تمثل الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد للخلايا الفلكية تقدما في هندسة الأنسجة العصبية ، مما يسمح با الصنع الحيوي للنماذج المختبرية المفيدة لفهم الآليات المشاركة في الأمراض العصبية. الميزة الرئيسية للطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد هي تصنيع الهياكل المساعدة للخلايا الحيوية التي تحاكي الميزات الكيميائية الحيوية والميكايكية للأنسجة ، مما يوفر فهما أفضل لديناميكيات الخلايا في الصحة والمرض. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على التصنيع الحيوي للأنسجة الرخوة الأخرى ، لأنه يستند إلى الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد للحبر الحيوي المكون من البوليمرات الطبيعية ومكونات المصفوفة خارج الخلية.
في البداية، قطع الأنسجة القشرية المعزولة من الماوس القتل الرحيم إلى قطع صغيرة مع مقص صغير منحني. غسل قطع الأنسجة ثلاث مرات مع ملليلتر واحد من HBSS عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. بعد إزالة HBSS المضافة للمرة الثالثة، إضافة ملليلتر واحد من 0.05٪ تريبسين واحتضان الأنسجة لمدة خمس دقائق في 37 درجة مئوية.
لتفكك الأنسجة الميكانيكية، ماصة بلطف خليط الأنسجة تريبسين صعودا وهبوطا 15 مرات. بعد ذلك، نقل الخليط المفكك إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر وإضافة حجم متساو من FBS لتحييد نشاط التريبسين. تصفية التعليق من خلال مرشح مصفاة الخلية 0.4 ميكرومتر لإزالة شظايا غير مفككة.
غسل مرشح مع ملليلتر واحد من الخلايا الفلكية المتوسطة. بيليه أسفل تعليق الخلية المصفاة عن طريق الطرد المركزي. بعد التخلص من supernatant، تعليق بيليه الخلية في ملليلتر واحد من الخلايا الفلكية ثقافة المتوسطة.
نقل تعليق الخلية إلى قارورة ثقافة T25. تشكل الحجم المتوسط الكلي من 3.5 ملليلتر واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. للحصول على الفيبرينوجين في التركيز النهائي من ثلاثة ملليغرام لكل ملليلتر, نقل 0.9 ملليلتر من 10 ملليغرام لكل ملليلتر فيبرينوجين حل إلى محلول الجيلاتين جيلاتين ميثاكريلويل.
للحصول على البادئ الصورة في التركيز النهائي من 0.5٪ الوزن من حيث الحجم، إضافة 0.015 غرام من البادئ الصورة إلى الحل إعداد الجيلاتين الجيلاتين ميثاكريلويل فيبرينوجين. بعد الدوامة، حافظ على الحل عند 40 درجة مئوية، محميا من الضوء لتجنب تدهور PI. بعد ذلك، قم بتصفية المحلول من خلال فلتر 0.2 ميكرومتر إلى أنبوب مخروطي معقم 15 ملليلتر.
نقل 980 ميكرولتر من محلول المواد الحيوية إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. للحصول على صفمين في التركيز النهائي من ميكروغرام اثنين لكل ملليلتر، إضافة 20 ميكرولتر من صفمين المخفف إلى أنبوب يحتوي على الحبر الحيوي. تخلط بلطف عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا، وتجنب فقاعات والحفاظ على حل الحبر الحيوي في 37 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للحصول على مختلطة مع الخلايا.
جرب الخلايا الفلكية الأولية مع 0.05٪ تريبسين لمدة 5 دقائق وتحييد نشاط التريبسين مع FPS بنسبة واحد إلى واحد. ثم، نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر والطرد المركزي في 200 مرة G لمدة خمس دقائق. بعد عد الخلايا، نقل 1 مرات 10 إلى 6 خلايا إلى أنبوب مخروطي مختلف والطرد المركزي كما هو موضح.
ترك فقط 200 ميكرولتر من supernatant في الأنبوب وتعليق بيليه الخلية عن طريق التنصت بلطف الجزء السفلي من الأنبوب المخروطي. للحصول على تركيز نهائي من 1 مرات 10 إلى 6 خلايا لكل ملليلتر، نقل ملليلتر واحد من الجيلاتين الجيلاتين ميثاكريويل فيبرينوجين حل للأنبوب الذي يحتوي على الخلايا والتجانس عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا. استخدام ماصة 1000 ميكرولتر لنقل ببطء الخلايا الفلكية وضعت في الجيلاتين الجيلاتين ميثاكريلويل فيبرينوجين حل الحبر الحيوي إلى حقنة بلاستيكية خمسة ملليلتر، وتجنب تشكيل فقاعة.
قم بتوصيل إبرة معقمة قياس 22 حادة إلى الحقنة. تعرض الطابعة الحيوية للأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة، ثم مسح الطابعة الحيوية بنسبة 70٪، ثم قم بتوصيل المحقنة برأس الطباعة المطبوعة الحيوية وامسح الحبر الحيوي يدويا لإزالة الفقاعات المتبقية. لإجراء الطباعة الحيوية، ضع طبق ثقافة 35 ملليمترا على طاولة الطباعة الحيوية، ضع الإبرة على بعد 0.1 ملليمتر من سطح طبق الثقافة للسماح بحركة الإبرة واضغط على زر الطباعة.
بمجرد انتهاء الطباعة الحيوية ، تأكد من أن الحقنة تبتعد عن الطبق وطبق الثقافة الوثيق. ضع طبق الثقافة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية للجيلاتين ميثاكريلويل عبر الربط. استخدام ملعقة معقمة لنقل بناء مطبوع بيولوجيا إلى لوحة بئر 24.
إضافة 500 ميكرولتر من محلول كلوريد الكالسيوم thrombin وترك لمدة 30 دقيقة للسماح الفيبرين عبر ربط. بعد إزالة الحل عبر ربط، وغسل بناء مع اثنين من ملليلتر من برنامج تلفزيوني، ثم استبدال برنامج تلفزيوني مع ملليلتر واحد من الخلايا الفلكية ثقافة المتوسطة. احتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون وتغيير المتوسطة كل ثلاثة أيام.
استخدام ملعقة لنقل بناء مطبوع بيولوجيا إلى طبق ثقافة 35 ملليمتر. غسل بناء مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني. إيداع 100 ميكرولتر من الكاشف الميت الحي فوق البناء وإبقائه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، مما يبقيه محميا من الضوء.
بعد إزالة الكاشف الميت الحي ، اغسل البناء مع PBS كما هو موضح. نقل العينة إلى طبق confocal ومراقبة الخلايا داخل بناء تحت المجهر confocal باستخدام 488 و 570 نانومتر الإثارة للحصول على الصورة. بعد الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد ، تم تقدير سلامة السقالة المطبوعة بيولوجيا ولوحظ تشكيل بنية محددة جيدا مع الخلايا المحاصرة داخل المادة الحيوية.
بعد الطباعة الحيوية وعمليات الربط المتبادل ، قدمت معظم الخلايا مورفولوجيا مستديرة عندما تم احتضان البناء مع وسيطة الخلايا الفلكية. حافظت السقالات المطبوعة بيولوجيا على سلامتها بعد سبعة أيام من الحضانة ، وعلى الرغم من ملاحظة بعض الخلايا المستديرة ، انتشرت العديد من الخلايا الفلكية في جميع أنحاء البناء ، مما يقدم مورفولوجيا فلكية وترابطا. تم تقييم صلاحية الخلية مباشرة بعد الطباعة الحيوية وأظهرت النتائج أنه بالسرعة المنخفضة ، تمثل الخلايا القابلة للحياة ما يصل إلى 74٪ من إجمالي الخلايا ، كونها أعلى بكثير من الخلايا المطبوعة بيولوجيا بسرعة أعلى.
تم تطبيع صلاحية الخلايا الفلكية المطبوعة بيولوجيا إلى الخلايا الفلكية المستزرعة 2D وأشارت النتائج إلى أنه في اليوم السابع ، زادت الخلايا الفلكية المطبوعة بيولوجيا بشكل كبير من قابليتها للحياة. مباشرة بعد الطباعة الحيوية، أظهرت الخلايا الفلكية مورفولوجيا مستديرة وقاية حية ميتة. بعد أسبوع واحد ، انتشرت الخلايا الفلكية في جميع أنحاء البناء وقدمت مورفولوجيا متميزة من الخلايا ، مطابقة للثقافة 2D.
تميزت الخلايا الفلكية المطبوعة بيولوجيا ثلاثية الأبعاد بفلورية المناعة. بعد سبعة أيام من الحضانة في البناء المطبوع بيولوجيا ، لوحظت خلايا أستراتية كثيفة للغاية مع مورفولوجيا تشبه النجوم. عبرت خلايا الخلايا الفلكية المطبوعة بيولوجيا عن البروتين الحمضي الرجفانى الرجفانى الغليظى المحدد الذى يشير إلى الاحتفاظ بالنمط الظاهري الفلكي بعد سبعة أيام من الطباعة الحيوية ، وتشير هذه النتائج إلى أن تكوين الحبر الحي وفر بيئة دقيقة قابلة للكومبيا لتعزيز التصاق الخلايا الفلكية وانتشارها ونموها .
تقييم جينات محددة وتعبير علامات الخلية من قبل الخلايا الفلكية المطبوعة بيولوجيا من شأنه أن يوفر دليلا على وظيفة تشبه الأنسجة العصبية، مثل التفاعل الفلكي بعد محفزات محددة. يمهد هذا البروتوكول الطريق لتحضير هياكل أكثر تعقيدا تشبه الأعصاب تتكون من أنواع مختلفة من الخلايا في الجزيئات الحيوية ، مما يسمح بمحاكاة منافذ عصبية محددة.
