We thank the laboratory of Dr. Stephen Moss for providing embryonic rat brain tissues. M.D.T. designed the original protocol. This work was funded by National Institutes of Health P41 Tissue Engineering Resource Center Grant EB002520. K.C. was supported with Postdoctoral Fellowship from German Research Foundation (DFG) (CH 1400/2-1).

وتمت الموافقة على بروتوكول العزلة أنسجة المخ من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي جامعة تافتس ويتوافق مع المعاهد الوطنية للصحة الدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام اللجنة B2011-45). 1. الحرير إعداد سقالة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد حل الحرير من الشرانق Bombyx موري كما هو موضح سابقا 19،20. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع كل شرنقة إلى 8 قطع متساوية باستخدام مقص. استخدام حوالي 11 الشرانق لمدة 5 غرام من الشرانق مجزأة. (15 دقيقة) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 2 لتر من 0.02 M نا 2 CO 3 الحل وجعله في الغليان باستخدام صفيحة ساخنة. (15 دقيقة) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن 5 غرام من الشرانق مجزأة وسلقها في نا 2 CO 3 الحل لمدة 30 دقيقة. تحريك الحرير المغلي كل بضع دقائق مع ملعقة. هذه الخطوة، كما دعا اجتثاث جومينج، ينقي فبروين الحرير من البروتينات محبة للماء، sericins. (30 دقيقة) </li><lط&gt; بكسر فبروين من قبل جهة وشطفه في الماء المقطر ثلاث مرات على الأقل لتغسل أي سيريسين والمواد الكيميائية المتبقية. (5 دقائق) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع فبروين الرطب على طبق بتري وتجفيف استخراج فبروين في غطاء تدفق O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي تزن كتلة فبروين الجافة ومكان فبروين في كوب زجاجي. (15 دقيقة) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل حل فبروين في 9.3 M LiBr الحل، وحساب حجم المطلوب (في مل) من LiBr بضرب كتلة فبروين الجافة التي كتبها 4. صب ببطء حل LiBr على فبروين الحرير وتزج جميع الألياف فبروين باستخدام الملعقة. تغطية الكأس لمنع التبخر ووضعه عند 60 درجة مئوية لمدة 4 ساعات للسماح للألياف بحل. (15 دقيقة) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام حقنة، وجمع الحل فبروين من كوب وتحميله في أشرطة غسيل الكلى MWCO 3500. أداء غسيل الكلى ضد الماء المقطر لمدة 48 ساعة. تغيير الماء كل بضع ساعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام حقنة، وجمع الحل فبروين منأشرطة الكاسيت إلى 50 مل أنابيب مخروطية وأجهزة الطرد المركزي مرتين في 9000 دورة في الدقيقة (~ 12700 x ج) في 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. صب طاف في أنبوب جديد بعد كل خطوة الطرد المركزي وتجاهل بيليه. (40 دقيقة) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس تركيز فبروين عن طريق تقدير الوزن الجاف. صب 1 مل من محلول الحرير في وزن القارب. تجفيف العينة في الفرن على 60 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. وزن فبروين الحرير الجاف وحساب تركيز محلول فبروين الحرير بضرب الوزن التي حصل عليها 100. تركيز المتوقع من حل الحرير هو 6-9٪ (ث / ت). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط تركيز الحرير إلى 6٪ (ث / ت) عن طريق تمييع في الماء المقطر. نقطة وقف: يمكن تخزين فبروين الحرير السائل عند 4 درجة مئوية لمدة شهر واحد في حاوية مغلقة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد السقالات التي يسهل اختراقها من حل الحرير. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ينخل كلوريد الصوديوم الحبيبية لفصل حبيبات بحجم 500-600 ميكرون، والتي سيتم استخدامها في خطوات لاحقة. تجاهل الحبيبيةالصورة الحجم أقل من 500 ميكرون وأكثر من 600 ميكرون. (15 دقيقة) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب 30 مل من محلول الحرير 6٪ في تترافلوروإيثيلين (PTFE) قالب (الشكل 1). بلطف مبعثر 60 غرام من كلوريد الصوديوم المصفى على الحرير. اضغط على الحاوية للحصول على طبقة موحدة من الملح. احتضان 48 ساعة على RT لبلمرة الحرير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع القالب PTFE التي تحتوي على سقالة في الفرن على 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لاستكمال البلمرة وتتبخر أي السائل المتبقي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع محتوى القالب PTFE في دورق يحتوي على 2 لتر من الماء المقطر لمدة 48 ساعة ليتش من الملح. تغيير الماء 2-3 مرات في اليوم الواحد. إزالة السقالات الاسفنجة من قوالب عندما الملح ترشح تماما من نقطة التوقف: يمكن تخزين الإسفنج مغمورة في الماء عند 4 درجات مئوية في حاوية مغلقة لمنع السقالات من الجفاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تصبح جاهزة، قطع السقالات مع 5 ملم خزعة قطر لكمة. قبل قطع السقالات لتصل إلى حوالي 2 ملم في الطول. بوNCH ​​من وسط سقالة مع 2 مم خزعة قطر لكمة (الشكل 2A). (1 ساعة) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأوتوكلاف السقالات مغمورة في الماء لتعقيم لهم (دورة الرطب، 121 ° C، 20 دقيقة) نقطة وقف: يمكن تخزين الإسفنج مغمورة في الماء عند 4 درجات مئوية في حاوية مغلقة لمنع السقالات من الجفاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل البذر الخلية المخططة، تزج السقالات في معقم 0.1 ملغ / مل بولي-D-ليسين (PDL) حل. احتضان لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل السقالات 3X مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لإزالة غير ملزمة PDL. (30 دقيقة) </li></ol></li></ol> 2. عزل الجرذ العصبونات القشرية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح القشور من يوم الجنينية 18 الفئران (E18) سبراغ داولي كما هو موضح سابقا من قبل Pacifici وبيروتزي 27 بعد الحصول على بروتوكول الحيوان المعتمدة. (2 ساعة) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان 10 القشور في 5 مل من 0.25٪ التربسين مع 0.3٪ الدناز I (من البنكرياس البقري) لمدة 20 دقيقة في 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إبطال نشاط التربسين بإضافة حجم مساو من 1 ملغ / مل بروتين فول الصويا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يسحن القشور باستخدام 10 مل ماصة باستور قبل pipetting صعودا وهبوطا من 20 مرات حتى يتم إنشاء تعليق خلية واحدة. أن يكون لطيف وتجنب تشكيل فقاعة الهواء. (10 دقيقة) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي تعليق خلية في 127 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعادة تعليق بيليه خلية في 10 مل من مستنبت (Neurobasal المتوسطة، 1X B27 تكملة، 1X Glutamax، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين). عد الخلايا. تركيز الخلية المتوقع حوالي 2x10 7 / مل. (20 دقيقة) </li></ol> 3. بانشاء الجمعية والثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سقالة البذر مع الخلايا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل السقالات العقيمة وجميع الأواني اللازمة داخل الخلية هود الثقافة. باستخدام ملقط معقم مكان السقالات في 96-جيدا لوحة زراعة الخلايا أن تخصيص سقالة واحد لكل بئر. (10 دقيقة) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج السقالات في مستنبت الخلية لكي تتوازن لهم قبل الخلية البذورجي. احتضان لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية. (10 دقيقة) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح الزيادة في المتوسط ​​من السقالات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق 100 ميكرولتر من تعليق خلية / سقالة. (10 دقيقة) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا عند 37 درجة CO / N للسماح مرفق الخلية إلى السقالة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في صباح اليوم التالي نضح الخلايا غير المرفقة وتطبيق 200 ميكرولتر / بئر مستنبت الطازجة. (10 دقيقة) </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سقالة تضمين مع الكولاجين المصفوفة. (2 ساعة) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 10X PBS، المياه، 1 N هيدروكسيد الصوديوم والفئران ذيل أنا الكولاجين على الجليد. يعد حل عمل الكولاجين وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. الحفاظ على الجليد حتى يبني المصنف خلية جاهزة (تصل إلى 1 ساعة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بنيات الحرير خلية المصنفة من الحاضنة ونضح تتجاوز المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط معقم نقل السقالات إلى الآبار الفارغة على لوحة جيدا وتزج كل سقالة في 100 ميكرولتر من 3 ملغ / مل حل الكولاجين. وضع لوحة زراعة الأنسجة الظهرفي الحاضنة لمدة 30 دقيقة للسماح للبلمرة الكولاجين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق 100 ميكرولتر من قبل تحسنت مستنبت خلية / جيد. ثقافة يبني لمدة أسبوع واحد تغيير المتوسط ​​كل يوم عن طريق استبدال سوى نصف حجم المتوسط. </li></ol></li></ol> 4. تحليل المجهر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحي / تلطيخ الميت (1 ساعة) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محلول المخزون من يوديد propidium (PI) 1 ملغ / مل (1.5 ملم) في الماء المقطر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محلول المخزون من ثنائي الأسيتات فلوريسئين (FDA) 2 ملغ / مل في الأسيتون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل عمل تتضمن 10 ميكرومتر PI و 0.15 ميكرومتر ادارة الاغذية والعقاقير المخففة في برنامج تلفزيوني. قبل الحارة الحل إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني قبل تحسنت لإزالة esterases المصل. نضح في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق حل الفريق استعد مسبقا على الخلايا لمدة 2 دقيقة ويغسل مع برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام المجهر epifluorescent لصورة الخلايا (PI السابق λ = 490 نانومتر، م λ = 570 نانومتر، FDA السابق λ = 490 نم، م λ = 514 نانومتر). لا تزال وصمة عار مستقرة أكثر من 40 دقيقة. تلطيخ لفترات طويلة قد يؤدي إلى تلطيخ غير محددة الناتجة عن امتصاص PI من قبل الخلايا وشارك في توطين PI / FDA في الخلايا. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المناعية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نقطة الوقت المطلوب للثقافة إصلاح الخلايا مع بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) لمدة 30 دقيقة في RT. نظرا لسمية PFA أبخرة يجب أن يتم تنفيذ الخطوة تحديد في غطاء الدخان الكيميائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل السقالات مع 3X PBS نقطة وقف: يمكن تخزين بنيات PFA الثابتة في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية لعدة أيام قبل الشروع في اتخاذ مزيد من الخطوات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان السقالات في 0.2٪ تريتون، 0.25٪ ألبومين المصل البقري (BSA) في برنامج تلفزيوني يحتوي على الأجسام المضادة الأولية O / N عند 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي تجاهل حل تلطيخ وغسل السقالات 3 × 30 دقيقة مع PBS لإزالة الأجسام المضادة الأولية غير منضم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان هذه العينات مع الأجسام المضادة الثانوية المخفف في 0.2٪ تريتون، 0.25٪ BSA في برنامج تلفزيوني ل2ساعة على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة حل تلطيخ وغسل السقالات 3 × 30 دقيقة مع PBS لإزالة الأجسام المضادة الثانوية غير منضم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة السقالات باستخدام مجهر متحد البؤر مع الهدف 20X بأخذ 100 ميكرون ض أجزاء من العينة مع 1 ميكرومتر الخطوة. لتصور neurites التي رقيقة يجب أن تكون دقة وضوح الصورة من الحد الأدنى 1024 X 1024 بكسل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RNA، DNA والبروتين العزلة ملاحظة: يتم تنفيذ RNA، DNA والبروتين العزلة باستخدام التجاري AllPrep DNA / RNA / البروتين كيت البسيطة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط معقم نقل السقالات من لوحة الثقافة إلى 2 مل أنبوب معقم. وضع السقالة واحدة في أنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر من العازلة RLT إلى كل أنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعطيل بناء عن طريق تفتيت مع microscissors معقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتجانس الأنسجة تعطلت، ونقل المحتوى من الأنبوب إلى عمود الدوران. تدور لمدة 2 دقيقة بأقصى سرعة في microcentrifuge.والمتجانس المحللة لأنها تمر من خلال عمود الدوران. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع التدفق من خلال واستخدامها على الفور لعزل RNA، DNA والبروتين بعد بروتوكول الشركة المصنعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس العائد من الأحماض النووية أي طريقة أخرى متوافقة (على سبيل المثال، معمل NanoDrop). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس العائد البروتين باستخدام BCA البروتين الفحص وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. قياس نتائج الفحص باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية الطول الموجي 562 نانومتر. ملاحظة: يتم عرض العائد المتوقع من الأحماض النووية والبروتين في بناء فيما يتعلق كثافة الخلية في الشكل (4). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Dua, T., Janca, A., Kale, R., Montero, F., Muscetta, A., Peden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+1,+Public+health+principles+and+neurological+disorders.">Chapter 1, Public health principles and neurological disorders.</a> Neurological Disorders. , (2005).</li><li>Ohtsuki, S., Hirayama, M., Ito, S., Uchida, Y., Tachikawa, M., Teresaki, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T.+Quantitative+targeted+proteomics+for+understanding+the+blood-brain+barrier:+towards+pharmacoproteomics.">T. Quantitative targeted proteomics for understanding the blood-brain barrier: towards pharmacoproteomics.</a> Expert. Rev. Proteomic. 11 (3), 303-313 (2014).</li><li>Hyder, F., Rothman, D. L., Bennett, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+energy+demands+of+signaling+and+nonsignaling+components+in+brain+are+conserved+across+mammalian+species+and+activity+levels.">Cortical energy demands of signaling and nonsignaling components in brain are conserved across mammalian species and activity levels.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110 (9), 3549-3554 (2013).</li><li>Wesseling, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combined+metabonomic+and+proteomic+approach+identifies+frontal+cortex+changes+in+a+chronic+phencyclidine+rat+model+in+relation+to+human+schizophrenia+brain+pathology.">A combined metabonomic and proteomic approach identifies frontal cortex changes in a chronic phencyclidine rat model in relation to human schizophrenia brain pathology.</a> Neuropsychopharmacology. 38 (12), 2532-2544 (2013).</li><li>Fawcett, J. W., Housden, E., Smith-Thomas, L., Meyer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growth+of+axons+in+three-dimensional+astrocyte+cultures.">The growth of axons in three-dimensional astrocyte cultures.</a> Dev Biol. 135 (2), 449-458 (1989).</li><li>Cullen, D. K., Simon, C. M., LaPlaca, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+rate-dependent+induction+of+reactive+astrogliosis+and+cell+death+in+three-dimensional+neuronal-astrocytic+co-cultures.">Strain rate-dependent induction of reactive astrogliosis and cell death in three-dimensional neuronal-astrocytic co-cultures.</a> Brain Res. 1158, 103-115 (2007).</li><li>East, E., de Oliveira, D. B., Golding, J. P., Phillips, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alignment+of+astrocytes+increases+neuronal+growth+in+three-dimensional+collagen+gels+and+is+maintained+following+plastic+compression+to+form+a+spinal+cord+repair+conduit.">Alignment of astrocytes increases neuronal growth in three-dimensional collagen gels and is maintained following plastic compression to form a spinal cord repair conduit.</a> Tissue Eng. Part A. 16 (10), 3173-3184 (2010).</li><li>Dubois-Dauphin, M. L., Toni, N., Julien, S. D., Charvet, I., Sundstrom, L. E., Stoppini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long-term+survival+of+in+vitro+engineered+nervous+tissue+derived+from+the+specific+neural+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells.">The long-term survival of in vitro engineered nervous tissue derived from the specific neural differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Biomaterials. 31 (27), 7032-7042 (2010).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Hogberg, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+3D+model+of+human+brain+development+for+studying+gene/environment+interactions.">Toward a 3D model of human brain development for studying gene/environment interactions.</a> Stem Cell Res Ther. 4, S4 (2013).</li><li>Kato-Negishi, M., Morimoto, Y., Onoe, H., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millimeter-sized+neural+building+blocks+for+3D+heterogeneous+neural+network+assembly.">Millimeter-sized neural building blocks for 3D heterogeneous neural network assembly.</a> Adv Healthc Mater. 2 (12), 1564-1570 (2013).</li><li>Watanabe, K., Nakamura, M., Okano, H., Toyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+three-dimensional+culture+of+neural+stem/progenitor+cells+in+collagen+type-1+gel.">Establishment of three-dimensional culture of neural stem/progenitor cells in collagen type-1 gel.</a> Restor Neurol Neurosci. 25 (2), 109-117 (2007).</li><li>Aurand, E. R., Wagner, J. L., Shandas, R., Bjugstad, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel+formulation+determines+cell+fate+of+fetal+and+adult+neural+progenitor+cells.">Hydrogel formulation determines cell fate of fetal and adult neural progenitor cells.</a> Stem Cell Res. 12 (1), 11-23 (2014).</li><li>Gurkan, U. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al..Simple+precision+creation+of+digitally+specified,+spatially+heterogeneous,+engineered+tissue+architectures.">et al..Simple precision creation of digitally specified, spatially heterogeneous, engineered tissue architectures.</a> Adv Mater. 25 (8), 1192-1198 (2013).</li><li>Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+printing:+computer-aided+jet-based+3D+tissue+engineering.">Organ printing: computer-aided jet-based 3D tissue engineering.</a> Trends Biotechnol. 21 (4), 157-161 (2003).</li><li>Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury,+regeneration+and+transport.">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nature. 2 (8), 599-605 (2005).</li><li>Tang-Schomer, M. D., Davies, P., Graziano, D., Thurber, A. E., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+circuits+with+long-distance+axon+tracts+for+determining+functional+connectivity.">Neural circuits with long-distance axon tracts for determining functional connectivity.</a> J Neurosci Methods. 222, 82-90 (2014).</li><li>Tang-Schomer, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+functional+brain-like+cortical+tissue.">Bioengineered functional brain-like cortical tissue.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 111 (38), 13811-13816 (2014).</li><li>Rockwood, D. N., Preda, R. C., Y&#252;cel, T., Wang, X., Lovett, M. L., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materials+fabrication+from+Bombyx+mori+silk+fibroin.">Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin.</a> Nat Protoc. 6, 1612-1631 (2011).</li><li>Lawrence, B. D., Pan, Z., Weber, M. D., Kaplan, D. L., Rosenblatt, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk+film+culture+system+for+in+vitro+analysis+and+biomaterial+design.">Silk film culture system for in vitro analysis and biomaterial design.</a> J. Vis. Exp. (62), e3646 (2012).</li><li>Maddah, M., Grimson, W. E., Warfield, S. K., Wells, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unified+framework+for+clustering+and+quantitative+analysis+of+white+matter+fiber+tracts.">A unified framework for clustering and quantitative analysis of white matter fiber tracts.</a> Med Image Anal. 12 (2), 191-202 (2008).</li><li>Vepari, C., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk+as+a+biomaterial.">Silk as a biomaterial.</a> Prog Polym Sci. 32 (8-9), 8-9 (2007).</li><li>Yao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salt-leached+silk+scaffolds+with+tunable+mechanical+properties.">Salt-leached silk scaffolds with tunable mechanical properties.</a> Biomacromolecules. 13 (11), 3723-3729 (2012).</li><li>Kim, U. J., Park, J., Kim, H. J., Wada, M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+aqueous-derived+biomaterial+scaffolds+from+silk+fibroin.">Three-dimensional aqueous-derived biomaterial scaffolds from silk fibroin.</a> Biomaterials. 26 (15), 2775-2785 (2005).</li><li>Gil, E. S., Mandal, B. B., Park, S. H., Marchant, J. K., Omentetto, F. G., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicoidal+multi-lamellar+features+of+RGD-functionalized+silk+biomaterials+for+corneal+tissue+engineering.">Helicoidal multi-lamellar features of RGD-functionalized silk biomaterials for corneal tissue engineering.</a> Biomaterials. 31 (34), 8953-8963 (2010).</li><li>Hopkins, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk+hydrogels+as+soft+substrates+for+neural+tissue+engineering.">Silk hydrogels as soft substrates for neural tissue engineering.</a> Adv Funct Mater. 23 (41), 5140-5149 (2013).</li><li>Pacifici, M., Peruzzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+rat+embryonic+neural+cells:+A+quick+protocol.">Isolation and culture of rat embryonic neural cells: A quick protocol.</a> Vis. Exp. (63), e3965 (2012).</li></ol>

برعاية نشر هذا المقال الفيديو عن طريق كورنينج.

Here we described the guidelines to assemble a compartmentalized 3D brain-like tissue model. The model is characterized by dense polarized culture of neurons resulting in the development of two morphologically different compartments: one containing densely packed cell bodies, second containing pure axonal networks. Overall, the scaffold architecture and growth pattern mimic brain cortical tissue including the six laminar layers and white matter tracts21.
The donut-shaped silk protein-based tissue model allows for modifications and tuning of mechanical properties, versatile structural forms, hydrogel fillers and cellular components. Thus, this tissue model establishes a base platform for a wide range of studies. Silk is a favorable candidate for biomaterial platforms due to its biocompatibility, aqueous-based processing, and robust mechanical and degradation properties22. The silk matrix also serves as a stable anchor to reduce collagen gel contraction over time in culture. The properties such as silk concentration and porosity of the scaffold used in this model have been previously adjusted to achieve optimal cell growth and mechanical properties resulting in brain-like tissue elasticity18,23,24. We suggest to keep these parameters constant to ensure the successful outcome and reproducibility of the experiments.
The 3D neuronal network formation was achieved by combining two types of biomaterials with different mechanical properties: a stiff scaffold to provide neuronal anchoring and a softer gel matrix to permit axon penetration and connectivity in 3D. Selective material preferences of the silk scaffold and soft hydrogel provide the underlying principle for compartmentalizing the neurons from the axonal connections. Due to the inert nature of the silk scaffold, functionalization with poly-D-lysine is required for neuronal attachment. However, other cell adhesion promoting factors can be applied such as RGD25 or fibronectin26. To achieve the 3D network formation the silk scaffold needs to be filled with hydrogel in a timely manner as soon as neurons are attached to the scaffold. Likewise, the collagen matrix filler can be replaced by other hydrogels, thus allowing the study of the influence of 3D extracellular environments on axonal network formation to serve as a platform to evaluate novel hydrogels in terms of neuronal compatibility. Additionally, apart from rat cortical neurons other neuronal sources such as hippocampal neurons or induced pluripotent cell (iPSc)-derived neurons can be utilized. Moreover, the tissue model can be used to study heterocellular interactions by including glial cells along with neurons and to build more complex brain-like tissue.
As shown previously, our model can be utilized to evaluate neuronal functionality in 3D microenvironment with a variety of assays such as cell viability, gene expression, LC-MS/MS and electrophysiology, thus demonstrating physiological relevance of the model18. Other methods, which are frequently utilized to evaluate 3D tissue-engineered constructs, such as immunostaining and microscopy8,9,11 can also be used to assess cell distribution and extent of axonal network formation. However, it has to be noted, that due to the high density of the collagen matrix, the penetration of antibodies and depth of the imaging is limited to few hundred micrometers. Moreover, the signal to noise ratio may be affected by nonspecific background fluorescence. This can be overcome by using lipophilic cell tracers and genetically expressed fluorescent proteins which diminish the need for immunostaining11. Alternatively, the imaging can be performed with 2-photon microscopy instead of usual one-photon technique, which may reduce the signal loss, photobleaching, and can be extended to several hundred micrometers of depth.
Summarizing, the silk and collagen-based brain-like tissue offers a robust platform to study neuronal networks in 3D and is a starting point for the development of more advanced models of neurological disorders in the future. Independent from the mode of evaluation, the relative simplicity of this tissue model supports its utility, success and reproducibility.

الجهاز العصبي المركزي (CNS) يمكن أن تتأثر مجموعة متنوعة من الاضطرابات التي تنطوي على الأوعية الدموية، الهيكلية والوظيفية، المعدية أو التنكسية. ما يقدر بنحو 6.8 مليون شخص يموتون سنويا نتيجة للاضطرابات العصبية، وهو ما يمثل عبئا الاجتماعي والاقتصادي المتزايد في جميع أنحاء العالم 1. ومع ذلك، سوى عدد قليل من اضطرابات الحصول على العلاجات المتاحة. ولذلك، هناك حاجة ماسة لوضع استراتيجيات علاجية مبتكرة للمرضى الذين يعانون من الاضطرابات العصبية. للأسف، فشلت العديد من العلاجات CNS المستهدفة خلال التجارب السريرية، ويرجع ذلك جزئيا إلى الاستفادة من عدم كفاية نماذج الأبحاث ما قبل السريرية، التي لا تسمح بتقييم الآثار الحادة والمزمنة مع قراءات من الناحية الفسيولوجية الوظيفية ذات الصلة. على الرغم من الجهود البحثية الهامة على مدى العقود الماضية، هناك كمية هائلة مجهولة حول بنية ووظيفة الجهاز العصبي المركزي. من أجل كسب المزيد من المعرفة، نماذج حيوانية هي في كثير من الأحيان لناإد لنموذج الحالات المرضية، مثل إصابات الدماغ (TBI) أو الخرف، وخاصة في الدراسات ما قبل السريرية. ومع ذلك، الحيوانات تختلف اختلافا كبيرا من البشر على حد سواء في تشريح الجهاز العصبي المركزي، وكذلك في وظيفة، التعبير الجيني والأيض 2-4. من ناحية أخرى، 2D الثقافات في المختبر هي طريقة شائعة للتحقيق في بيولوجيا الخلية وتستخدم بشكل روتيني لاكتشاف الأدوية. ومع ذلك، مزارع الخلايا 2D تفتقر إلى التعقيد والأهمية الفسيولوجية بالمقارنة مع الدماغ البشري 5-7. في حين لا يوجد بديل عن التكلفة المنخفضة وبساطة 2D دراسات ثقافة الخلية أو تعقيد المقدمة من النماذج الحيوانية، يمكن أن هندسة الأنسجة 3D توليد نماذج محسنة البحوث من أجل سد الفجوة القائمة بين 2D في التجارب المختبرية والنهج الجسم الحي. تقدم هندسة الأنسجة 3D الظروف التجريبية أكثر ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية التي كتبها 3D التفاعلات خلية خلية والعظة خارج الخلية التي تقدمها السقالات بيولوجية تحقيقها. Despالفنار الأدلة كبير وراء قيمة الثقافات 3D، وهناك حاليا سوى عدد قليل 3D CNS نماذج الأنسجة مثل الجذعية المشتقة من خلية ثقافات عضوي الشكل 8-10، neurospheroids 11 ومشتتة الثقافات هيدروجيل 12،13. وقد تم استخدام الأساليب الفنية المتطورة بما في ذلك متعددة الطبقات الحجرية 14، و3D الطباعة 15 لدراسة الرئة والكبد وأنسجة الكلى. ومع ذلك، هناك عدم وجود نماذج 3D CNS التي تسمح للنمو الخلايا العصبية مجزأة، مثل محاكاة العمارة القشرية وعلم الأحياء. وقد تم فصل النمو من neurites التي من أجسام الخلايا العصبية سابقا أظهر في الثقافات 2D باستخدام التصنيع الدقيق 16،17 السماح للدراسة تتبع محور عصبي المسالك، تدفق الكالسيوم وهندسة الشبكات والأنشطة. ألهمتنا هذه الفكرة لتطوير الأنسجة العصبية الاستقطاب 3D حيث توجد أجسام الخلايا ومساحات محور عصبي في أماكن مختلفة تحاكي العمارة الطبقات من الدماغ 18 </sup&gt;. ويستند نهجنا على استخدام فريدة من نوعها الحرير تصميم سقالة التي تستوعب كثافة عالية من الخلايا في حجم المحصورة ويسمح ثمرة من شبكة كثيفة محور عصبي إلى هلام الكولاجين. نحن هنا لشرح إجراءات التجميع الكامل لمثل الدماغ الأنسجة بما في ذلك تصنيع السقالة وثقافة العصبية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Na2CO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>223530</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiBr</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>213225</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MWCO 3500 dialysis cassettes&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>66110</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Isotemp</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>No. 270, No. 35, No. 30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE mold</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>made in house (Figure 1) 10 cm diameter, 2 cm height</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71382</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Punch 5mm</td>
			<td>World Precision Instrument</td>
			<td>501909</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Punch 2mm</td>
			<td>World Precision Instrument</td>
			<td>501908</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6407-5MG</td>
			<td>final concentration 10 ug/ml, dissolved in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1283-500ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049-500ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td>final concentration 0.3%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soybean protein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6522-100MG</td>
			<td>final concentration 1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>warm up to 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement 50x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail, 100 mg</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td>final concentration 3 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2770</td>
			<td>corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170-10MG</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Diacetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7378-5G</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus MVX10</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>toxic, final concentration 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-10G</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#946;IIITubulin antibody&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2200</td>
			<td>rabbit 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit Alexa-546</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11010</td>
			<td>goat 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023-5ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP2 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td>objective 20x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAshredder</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80004</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol, Pure</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023&#160;</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000c/2000 UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader Spectramax M2</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>-</td>
			<td>absorbance 562 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Scissors, Economy, Vannas-type</td>
			<td>TedPella</td>
			<td>1346</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

engineered 3d silk-collagen-based model of polarized neural tissue

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a deeper comprehension of the neural system scientists aim to simplistically reconstruct the tissue by assembling it in vitro from basic building blocks using a tissue engineering approach. Our group developed a tissue-engineered silk and collagen-based 3D brain-like model resembling the white and gray matter of the cortex. The model consists of silk porous sponge, which is pre-seeded with rat brain-derived neurons, immersed in soft collagen matrix. Polarized neuronal outgrowth and network formation is observed with separate axonal and cell body localization. This compartmental architecture allows for the unique development of niches mimicking native neural tissue, thus enabling research on neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell and cell-matrix interactions and electrical functions.

الصلبة الإسفنج الحرير قبل القطع على شكل دونات تمثل فكرة فريدة من نوعها وبسيطة لتحقيق بنية مجزأة تشبه الأنسجة العصبية (الشكل 2A). بنية مسامية عالية من السقالة مع حجم المسام من حوالي 500 ميكرون النتائج في مساحة مرتفعة بشكل استثنائي مما يتيح للزرع ونمو كثافة الخلايا عالية ضمن حجم صغير (2x10 7 / مل) (الشكل 2B). بالإضافة إلى ذلك، المسامية العالية للسقالة يسمح للنشر غير المقيد من المواد الغذائية والنفايات الناتجة في جدوى متفوقة من مزارع الخلايا كثيفة على مدى فترات زمنية طويلة. على بذر الخلايا العصبية إرفاق بسرعة وبشكل موحد على السطح من مسام سقالة. بعد التعلق خلية كاملة ويتم معايرتها الخلايا على الركيزة الحرير، ويتم تعبئة سقالة الإسفنج مع مصفوفة الكولاجين لينة من أجل توفير بيئة 3D لتشكيل شبكة محور عصبي (الشكل 3 </strong&gt;). في غياب مصفوفة الكولاجين تجزئة من المحاور والهيئات الخلية غير ممكن كما تنمو الخلايا العصبية ملحقات فقط على سطح المسام مما أدى إلى شبكات مختلطة كما وجدت مع الأسطح 2D (الشكل 3B). في المقابل، يقدم جل الكولاجين كانت شبكة التي تدعم نمو محور عصبي واسعة في 3D، بينما تبقى الخلايا العصبية الهيئات تعلق على سقالة الحرير (الشكل 3C). هذا نمط النمو يؤدي إلى تجزئة أجسام الخلايا والشبكات محور عصبي نقية (الشكل 3D)، الذي يشبه المادة الرمادية والمادة البيضاء من القشرة في المخ. وبصرف النظر عن المجهري، يمكن تقييم يبني مع مجموعة متنوعة من الأساليب الأخرى 18، اعتمادا على مسألة وراء التجربة. على سبيل المثال، وعزل DNA، RNA والبروتين من بنيات يمكن أن يكون بسهولة تنفيذها باستخدام مجموعات تجارية (الشكل 4). العائد من الأحماض النووية والبروتين البولي ايثيلينص بناء يعتمد على عدد من الخلايا المصنفة في البداية على السقالات الحرير. المصنفة على المزيد من الخلايا وارتفاع العائد من DNA، RNA والبروتين. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/52970/52970fig1.jpg" /> الرقم العفن 1. PTFE تستخدم لإعداد الإسفنج الحرير سقالة الأبعاد: 10 سم القطر، 2 سم ارتفاع <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52970/52970fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/52970/52970fig2.jpg" /> الشكل 2. نموذج 3D نسيج يشبه الدماغ. (A) المسامية سقالة الإسفنج الحرير. (B) لايف / تلطيخ القتلى من الخلايا العصبية في يوم 1 على البذر على سقالة الحرير قبل التضمين الكولاجين (خلايا خضراء حية، والخلايا الحمراء الميتة). لوحات على الجانب الأيمن تظهر أماهgnification من منطقة المأسورة في إطارات الحمراء. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52970/52970fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52970/52970fig3.jpg" /> الشكل 3. العصبية ثمرة مجزأة في مثل الدماغ نموذج الأنسجة 3D (A) حجرات سقالة: الخلايا الحمراء مقصورة الجسم، مقصورة بلو محور عصبي. (B) نمط نمو الخلايا العصبية في يوم 1 على البذر قبل الكولاجين التضمين. (C). ثمرة العصبية في يوم 7 على البذر في المقصورة خلايا الجسم. (D) ثمرة العصبية في يوم 7 على البذر في المقصورة محور عصبي. الأخضر - βIIITubulin <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52970/52970fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا</a>الشكل. <img alt="الرقم 4" src="/files/ftp_upload/52970/52970fig4.jpg" /> الرقم 4. المتوقعة العائد من (A) RNA والحمض النووي، و (B) البروتين في بناء فيما يتعلق كمية من الخلايا المصنفة في سقالة (± SD، ن = 5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52970/52970fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم .</a>

Watch this Scientific Journal Video about Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue at JoVE.com

Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue

Insight into the complex actions of the brain requires advanced research tools. Here we demonstrate a novel silk-collagen-based 3D engineered model of neural tissue resembling brain-like architecture. The model can be used to study neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell interactions and electrical activity.

استنادا الحرير الكولاجين المهندسة 3D نموذج الاستقطاب العصبية الأنسجة

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a ...

engineered-3d-silk-collagen-based-model-of-polarized-neural-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.4K Views.  Tufts University. Insight into the complex actions of the brain requires advanced research tools. Here we demonstrate a novel silk-collagen-based 3D engineered model of neural tissue resembling brain-like architecture. The model can be used to study neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell interactions and electrical activity.

Video: Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the central nervous system1,2. These endogenous EFs are generated by cellular regulation of ionic transport combined with the electrical resistance of cells and tissues. It has been reported that applied EF treatment can promote functional repair of spinal cord injuries in animals and humans3,4. In particular, EF-directed cell migration has been demonstrated in a wide variety of cell types5,6, including neural progenitor cells (NPCs)7,8. Application of direct current (DC) EFs is not a commonly available technique in most laboratories. We have described detailed protocols for the application of DC EFs to cell and tissue cultures previously5,11. Here we present a video demonstration of standard methods based on a calculated field strength to set up 2D and 3D environments for NPCs, and to investigate cellular responses to EF stimulation in both single cell growth conditions in 2D, and the organotypic spinal cord slice in 3D. The spinal cordslice is an ideal recipient tissue for studying NPC ex vivo behaviours, post-transplantation, because the cytoarchitectonic tissue organization is well preserved within these cultures9,10. Additionally, this ex vivo model also allows procedures that are not technically feasible to track cells in vivo using time-lapse recording at the single cell level. It is critically essential to evaluate cell behaviours in not only a 2D environment, but also in a 3D organotypic condition which mimicks the in vivo environment. This system will allow high-resolution imaging using cover glass-based dishes in tissue or organ culture with 3D tracking of single cell migration in vitro and ex vivo and can be an intermediate step before moving onto in vivo paradigms.

This protocol demonstrates methods used to establish 2D and 3D environments in custom-designed electrotactic chambers, which can track cells in vivo/ex vivo using time-lapse recording at the single cell level, in order to investigate galvanotaxis/electrotaxis and other cellular responses to direct current (DC) electric fields (EFs).

الكهربائية الميدانية التي تسيطر عليها هجرة إخراج من الخلايا العصبية السلف في البيئات 2D و 3D

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the ...

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use of destructive assessment is not acceptable. A proposed alternative is the use of an imaging process called magnetic resonance elastography. Elastography is a nondestructive method for determining the engineered outcome by measuring local mechanical property values (i.e., complex shear modulus), which are essential markers for identifying the structure and functionality of a tissue. As a noninvasive means for evaluation, the monitoring of engineered constructs with imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) has seen increasing interest in the past decade1. For example, the magnetic resonance (MR) techniques of diffusion and relaxometry have been able to characterize the changes in chemical and physical properties during engineered tissue development2. The method proposed in the following protocol uses microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE) as a noninvasive MR based technique for measuring the mechanical properties of small soft tissues3. MRE is achieved by coupling a sonic mechanical actuator with the tissue of interest and recording the shear wave propagation with an MR scanner4. Recently, &mu;MRE has been applied in tissue engineering to acquire essential growth information that is traditionally measured using destructive mechanical macroscopic techniques5. In the following procedure, elastography is achieved through the imaging of engineered constructs with a modified Hahn spin-echo sequence coupled with a mechanical actuator. As shown in Figure 1, the modified sequence synchronizes image acquisition with the transmission of external shear waves; subsequently, the motion is sensitized through the use of oscillating bipolar pairs. Following collection of images with positive and negative motion sensitization, complex division of the data produce a shear wave image. Then, the image is assessed using an inversion algorithm to generate a shear stiffness map6. The resulting measurements at each voxel have been shown to strongly correlate (R2&gt;0.9914) with data collected using dynamic mechanical analysis7. In this study, elastography is integrated into the tissue development process for monitoring human mesenchymal stem cell (hMSC) differentiation into adipogenic and osteogenic constructs as shown in Figure 2.

The procedure demonstrates the methodology of magnetic resonance elastography for monitoring the engineered outcome of adipose and osteogenic tissue engineered constructs through noninvasive local assessment of the mechanical properties using microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE).

المغناطيسي منهجية Elastography الرنين لتقييم الأنسجة المهندسة النمو كونستركت

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Protocol for Relative Hydrodynamic Assessment of Tri-leaflet Polymer Valves

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of tri-leaflet polymer valve prostheses. However, identification of a protocol for initial assessment of polymer valve hydrodynamic functionality is paramount during the early stages of the design process. Traditional in vitro pulse duplicator systems are not configured to accommodate flexible tri-leaflet materials; in addition, assessment of polymer valve functionality needs to be made in a relative context to native and prosthetic heart valves under identical test conditions so that variability in measurements from different instruments can be avoided. Accordingly, we conducted hydrodynamic assessment of i) native (n = 4, mean diameter, D = 20 mm), ii) bi-leaflet mechanical (n= 2, D = 23 mm) and iii) polymer valves (n = 5, D = 22 mm) via the use of a commercially available pulse duplicator system (ViVitro Labs Inc, Victoria, BC) that was modified to accommodate tri-leaflet valve geometries. Tri-leaflet silicone valves developed at the University of Florida comprised the polymer valve group. A mixture in the ratio of 35:65 glycerin to water was used to mimic blood physical properties. Instantaneous flow rate was measured at the interface of the left ventricle and aortic units while pressure was recorded at the ventricular and aortic positions. Bi-leaflet and native valve data from the literature was used to validate flow and pressure readings. The following hydrodynamic metrics were reported: forward flow pressure drop, aortic root mean square forward flow rate, aortic closing, leakage&#160;and regurgitant volume, transaortic closing, leakage, and total energy losses. Representative results indicated that hydrodynamic metrics from the three valve groups could be successfully obtained by incorporating a custom-built assembly into a commercially available pulse duplicator system and subsequently, objectively compared to provide insights on functional aspects of polymer valve design.

There has been renewed interest in developing polymer valves. Here, the objectives are to demonstrate the feasibility of modifying a commercial pulse duplicator to accommodate tri-leaflet geometries and to define a protocol to present polymer valve hydrodynamic data in comparison to native and prosthetic valve data collected under near-identical conditions.

بروتوكول لتقييم هيدرودينامي النسبية للثلاثي النشرة بوليمر صمامات

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture systems, which inadequately reflect physiological conditions in vivo. Biological 3D matrices provide cells an environment in which cells can self-organize, allowing the study of tissue organization and cell differentiation. Such scaffolds can be seeded with a mixture of different cell types to study direct 3D cell-cell-interactions. To mimic the 3D complexity of cancer tumors, our group has developed a 3D in vitro tumor test system.	
	Our 3D tissue test system models the in vivo situation of malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs), which we established with our decellularized porcine jejunal segment derived biological vascularized scaffold (BioVaSc). In our model, we reseeded a modified BioVaSc matrix with primary fibroblasts, microvascular endothelial cells (mvECs) and the S462 tumor cell line. For static culture, the vascular structure of the BioVaSc is removed and the remaining scaffold is cut open on one side (Small Intestinal Submucosa SIS-Muc). The resulting matrix is then fixed between two metal rings (cell crowns).	
	Another option is to culture the cell-seeded SIS-Muc in a flow bioreactor system that exposes the cells to shear stress. Here, the bioreactor is connected to a peristaltic pump in a self-constructed incubator. A computer regulates the arterial oxygen and nutrient supply via parameters such as blood pressure, temperature, and flow rate. This setup allows for a dynamic culture with either pressure-regulated pulsatile or constant flow.	
	In this study, we could successfully establish both a static and dynamic 3D culture system for MPNSTs. The ability to model cancer tumors in a more natural 3D environment will enable the discovery, testing, and validation of future pharmaceuticals in a human-like model.

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Methods to create human 3D tumor tissues as test systems are described. These technologies are based on a decellularized Biological Vascularized Scaffold (BioVaSc), primary human cells and a tumor cell line, which can be cultured under static as well as under dynamic conditions in a flow bioreactor.

هندسة الأنسجة ل3D الإنسان<em&gt; في المختبر</em&gt; نظام ورم اختبار

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.

Here, we present a protocol to generate tissue engineered vessel grafts that are functional for grafting into mice by double seeding partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) - derived smooth muscle cells and PiPSC - derived endothelial cells on a decellularized vessel scaffold bioreactor.

جيل ومسمار سفن الهندسة الأنسجة في نموذج الفأر

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore esophageal adenocarcinoma generally has a poor prognosis, with little improvement in survival rates in recent years. These are difficult conditions to study and there has been a lack of suitable experimental platforms to investigate disorders of the esophageal mucosa.
A model of the human esophageal mucosa has been developed in the MacNeil laboratory which, unlike conventional 2D cell culture systems, recapitulates the cell-cell and cell-matrix interactions present in vivo and produces a mature, stratified epithelium similar to that of the normal human esophagus. Briefly, the model utilizes non-transformed normal primary human esophageal fibroblasts and epithelial cells grown within a porcine-derived acellular esophageal scaffold. Immunohistochemical characterization of this model by CK4, CK14, Ki67 and involucrin staining demonstrates appropriate recapitulation of the histology of the normal human esophageal mucosa.
This model provides a robust, biologically relevant experimental model of the human esophageal mucosa. It can easily be manipulated to investigate a number of research questions including the effectiveness of pharmacological agents and the impact of exposure to environmental factors such as alcohol, toxins, high temperature or gastro-esophageal refluxate components. The model also facilitates extended culture periods not achievable with conventional 2D cell culture, enabling, inter alia, the study of the impact of repeated exposure of a mature epithelium to the agent of interest for up to 20 days. Furthermore, a variety of cell lines, such as those derived from esophageal tumors or Barrett&#8217;s Metaplasia, can be incorporated into the model to investigate processes such as tumor invasion and drug responsiveness in a more biologically relevant environment.

This manuscript describes the production, characterization and potential uses of a tissue engineered 3D esophageal construct prepared from normal primary human esophageal fibroblast and squamous epithelial cells seeded within a de-cellularized porcine scaffold. The results demonstrate the formation of a mature stratified epithelium similar to the normal human esophagus.

إنتاج وتوصيف والمحتملة استخدامات الأنسجة المهندسة-3D الإنسان المريء المخاطي نموذج

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific mutational background. The model is generated on a decellularized porcine scaffold that reproduces tissue-specific characteristics regarding extracellular matrix composition and architecture including the basement membrane. We standardized a protocol that allows artificial tumor tissue generation within 14 days including three days of drug treatment. Our article provides several detailed descriptions of 3D read-out screening techniques like the determination of the proliferation index Ki67 staining&#39;s, apoptosis from supernatants by M30-ELISA and assessment of epithelial to mesenchymal transition (EMT), which are helpful tools for evaluating the effectiveness of therapeutic compounds. We could show compared to 2D culture a reduction of proliferation in our 3D tumor model that is related to the clinical situation. Despite of this lower proliferation, the model predicted EGFR-targeted drug responses correctly according to the biomarker status as shown by comparison of the lung carcinoma cell lines HCC827 (EGFR -mutated, KRAS wild-type) and A549 (EGFR wild-type, KRAS-mutated) treated with the tyrosine-kinase inhibitor (TKI) gefitinib. To investigate drug responses of more advanced tumor cells, we induced EMT by long-term treatment with TGF-beta-1 as assessed by vimentin/pan-cytokeratin immunofluorescence staining. A flow-bioreactor was employed to adjust culture to physiological conditions, which improved tissue generation. Furthermore, we show the integration of drug responses upon gefitinib treatment or TGF-beta-1 stimulation - apoptosis, proliferation index and EMT - into a Boolean in silico model. Additionally, we explain how drug responses of tumor cells with a specific mutational background and counterstrategies against resistance can be predicted. We are confident that our 3D in vitro approach especially with its in silico expansion provides an additional value for preclinical drug testing in more realistic conditions than in 2D cell culture.

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

We present a three-dimensional (3D) lung cancer model based on a biological collagen scaffold to study sensitivity towards non-small-cell-lung-cancer-(NSCLC)-targeted therapies. We demonstrate different read-out techniques to determine the proliferation index, apoptosis and epithelial-mesenchymal transition (EMT) status. Collected data are integrated into an in silico model for prediction of drug sensitivity.

والأنسجة المشتركة 3D هندسيا<em&gt; في المختبر</em&gt; /<em&gt; في السيليكو</em&gt; الرئة نموذج الورم للتنبؤ فعالية الدواء في خلفيات الطفرات محددة

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both cartilage and skin analogs were fabricated after bioink pre-cellularization utilizing a novel passive mixing unit technique. This technique was developed with the aim to simplify the steps involved in the mixing of a cell suspension into a highly viscous bioink. The resolution of filaments deposited through bioprinting necessitates the assurance of uniformity in cell distribution prior to printing to avoid the deposition of regions without cells or retention of large cell clumps that can clog the needle. We demonstrate the ability to rapidly blend a cell suspension with a bioink prior to bioprinting of both cartilage and skin analogs. Both tissue analogs could be cultured for up to 4 weeks. Histological analysis demonstrated both cell viability and deposition of tissue specific extracellular matrix (ECM) markers such as glycosaminoglycans (GAGs) and collagen I respectively.

Cartilage and skin analogs were bioprinted using a nanocellulose-alginate based bioink. The bioinks were cellularized prior to printing via a single step passive mixing unit. The constructs were demonstrated to be uniformly cellularized, have high viability, and exhibit favorable markers of differentiation.

بيوبرينتينج الغضاريف والجلد الأنسجة النظير استخدام سلبية رواية خلط وحدة تقنية بريسيلولاريزيشن بيوينك

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional tissue. Tissue engineering holds great promise as a potential solution with its ability to integrate cells and signaling molecules into a 3-dimensional scaffold. Recent work with tissue engineered tracheal grafts (TETGs) has seen some success but their translation has been limited by graft stenosis, graft collapse, and delayed epithelialization. In order to investigate the mechanisms driving these issues, we have developed a mouse model for tissue engineered tracheal graft implantation. TETGs were constructed using electrospun polymers polyethylene terephthalate (PET) and polyurethane (PU) in a mixture of PET and PU (20:80 percent weight). Scaffolds were then seeded using bone marrow mononuclear cells isolated from 6-8 week-old C57BL/6 mice by gradient centrifugation. Ten million cells per graft were seeded onto the lumen of the scaffold and allowed to incubate overnight before implantation between the third and seventh tracheal rings. These grafts were able to recapitulate the findings of stenosis and delayed epithelialization as demonstrated by histological analysis and lack of Keratin 5 and Keratin 14 basal epithelial cells on immunofluorescence. This model will serve as a tool for investigating cellular and molecular mechanisms involved in host remodeling.

Graft stenosis poses a critical obstacle in tissue engineered airway replacement. To investigate cellular mechanisms underlying stenosis, we utilize a murine model of tissue engineered tracheal replacement with seeded bone marrow mononuclear cells (BM-MNC). Here, we detail our protocol, including scaffold manufacturing, BM-MNC isolation, graft seeding, and implantation.

بذر وغرس الاختلاس الرغامى السكروز هندسة الأنسجة في طراز الماوس

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional ...

Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant technique with nutritional support. Recently, there have been many attempts at esophageal tissue engineering, but the success rate has been limited due to difficulty in early epithelization in the special environment of peristalsis. Here, we developed an artificial esophagus that can improve the regeneration of the esophageal mucosa and muscle layers through a two-layered tubular scaffold, a mesenchymal stem cell-based bioreactor system, and a bypass feeding technique with modified gastrostomy. The scaffold is made of polyurethane (PU) nanofibers in a cylindrical shape with a three-dimensional (3D) printed polycaprolactone strand wrapped around the outer wall. Prior to transplantation, human-derived mesenchymal stem cells were seeded into the lumen of the scaffold, and bioreactor cultivation was performed to enhance cellular reactivity. We improved the graft survival rate by applying surgical anastomosis and covering the implanted prosthesis with a thyroid gland flap, followed by temporary nonoral gastrostomy feeding. These grafts were able to recapitulate the findings of initial epithelialization and muscle regeneration around the implanted sites, as demonstrated by histological analysis. In addition, increased elastin fibers and neovascularization were observed in the periphery of the graft. Therefore, this model presents a potential new technique for circumferential esophageal reconstruction.

Esophageal reconstruction is a challenging procedure, and development of a tissue-engineered esophagus that enables regeneration of esophageal mucosa and muscle and that can be implanted as an artificial graft is necessary. Here, we present our protocol to generate an artificial esophagus, including scaffold manufacturing, bioreactor cultivation, and various surgical techniques.

الترقيع المهندس بالأنسجة لإعادة بناء المريء المحيطي في الفئران

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant ...