A bioimpressão 3D de astrócitos representa um avanço na engenharia de tecidos neurológicos, permitindo a biofabariação de modelos in vitro que são úteis para entender os mecanismos envolvidos em doenças neurológicas. A principal vantagem da bioimpressão 3D é biofabritar estruturas adjuntas celulares que imitam as características bioquímicas e mecânicas dos tecidos, proporcionando uma melhor compreensão da dinâmica celular em saúde e doenças. Este protocolo pode ser aplicado à biofabização de outros tecidos moles, pois é baseado na bioimpressão 3D de uma bioind tinta composta de polímeros naturais e componentes de matriz extracelular.
Para começar, corte o tecido cortical isolado do rato eutanizado em pequenos pedaços com uma micro tesoura curvada. Lave os pedaços de tecido três vezes com um mililitro de HBSS, encanar para cima e para baixo. Depois de remover o HBSS adicionado pela terceira vez, adicione um mililitro de 0,05% de trippsina e incuba o tecido por cinco minutos a 37 graus Celsius.
Para dissociação de tecido mecânico, pipeta suavemente a mistura de trippsina tecidual para cima e para baixo 15 vezes. Em seguida, transfira a mistura dissociada para um tubo cônico de 15 mililitros e adicione um volume igual de FBS para neutralizar a atividade de trippsina. Filtre a suspensão através de um filtro de coador de células de 0,4 micrômetros para remover fragmentos não dissociados.
Lave o filtro com um mililitro de meio de astrócito. Pelota para baixo a suspensão celular filtrada por centrifugação. Depois de descartar o supernatante, suspenda a pelota celular em um mililitro do meio de cultura de astrócitos.
Transfira a suspensão da célula para um frasco de cultura T25. Compõem o volume médio total de 3,5 mililitros e incubam as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Para obter o fibrinogênio na concentração final de três miligramas por mililitro, transfira 0,9 mililitros de 10 miligramas por solução de fibrinogeniliter para a solução de methacryloyl gelatina-gelatina.
Para obter o iniciador fotográfico na concentração final de 0,5% de peso em volume, adicione 0,015 gramas de iniciador fotográfico à solução preparada de fibrinogen de gelatina-gelatina. Após o vórtice, mantenha a solução a 40 graus Celsius, protegida da luz para evitar a degradação do PI. Em seguida, filtre a solução através de um filtro de 0,2 micrômetros em um tubo cônico estéril de 15 mililitros.
Transfira 980 microliters da solução biomaterial para um tubo cônico de 15 mililitros. Para obter a laminina na concentração final de dois microgramas por mililitro, adicione 20 microliters de laminina diluída ao tubo contendo biointa. Misture suavemente por pipetting para cima e para baixo, evitando bolhas e mantenha a solução de bio tinta a 37 graus Celsius até ficar pronta para se misturar com as células.
Trypsinize os astrócitos primários com 0,05% de trippsina por 5 minutos e neutralize a atividade de trippsina com FPS em uma proporção de um para um. Em seguida, transfira as células para um tubo cônico de 15 mililitros e centrífuga a 200 vezes G por cinco minutos. Após contar as células, transfira 1 vezes 10 para as 6 células para um tubo cônico diferente e centrífuga como demonstrado.
Deixe apenas 200 microlitres do supernatante no tubo e suspenda a pelota celular tocando suavemente o fundo do tubo cônico. Para obter uma concentração final de 1 vezes 10 a 6 células por mililitro, transfira um mililitro de solução de fibrinogen de gelatina-gelatina para o tubo contendo as células e homogeneize-se gentilmente tubos para cima e para baixo. Use uma pipeta de 1000 microliter para transferir lentamente os astrócitos colocados em gelatina-gelatina fibrinogen biobrinogen bio-ink solução para uma seringa plástica de cinco mililitros, evitando a formação de bolhas.
Conecte uma agulha cega estéril de calibre 22 à seringa. Exponha a bioimpressora à luz UV por 15 minutos e, em seguida, limpe a bioimpressora com 70% de etanol, em seguida, conecte a seringa à cabeça de impressão bioimpressora e lave manualmente a tinta biológica para remover as bolhas restantes. Para realizar a bioimpressão, coloque em um prato de cultura de 35 milímetros na mesa bioimpressora, posicione a agulha a 0,1 milímetros da superfície do prato de cultura para permitir o movimento da agulha e pressione o botão Imprimir".
Uma vez que a bioimpressão acabou, certifique-se de que a seringa se afasta do prato e feche o prato de cultura. Coloque o prato de cultura sob luz UV para gelatina methacryloyl cross-linking. Use uma espátula estéril para transferir a construção bioimpressora para uma placa de 24 poços.
Adicione 500 microliters de solução de cloreto de cálcio de trombina e deixe por 30 minutos para permitir a ligação cruzada de fibrinas. Depois de remover a solução de ligação cruzada, lave a construção com dois mililitros de PBS e substitua o PBS por um mililitro de meio de cultura de astrócitos. Incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono e alterar o meio a cada três dias.
Use uma espátula para transferir a construção bioimpressora para um prato de cultura de 35 milímetros. Lave a construção com um mililitro de PBS. Deposite 100 microlitres do reagente morto vivo sobre a construção e mantenha-o a 37 graus Celsius por 30 minutos, mantendo-o protegido da luz.
Depois de remover o reagente morto vivo, lave a construção com PBS como demonstrado. Transfira a amostra para um prato confocal e observe as células dentro do construto sob um microscópio confocal usando excitação de 488 e 570 nanômetros para aquisição de imagem. Após a bioimpressão 3D, a integridade do andaime bioimpresso foi estimada e a formação de uma estrutura bem definida foi observada com células presas dentro do biomamaterial.
Após a bioimpressão e os processos de ligação cruzada, a maioria das células apresentava morfologia redonda quando a construção era incubada com um meio de astrócito. Os andaimes bioimpressos mantiveram a integridade após sete dias de incubação, e embora algumas células redondas tenham sido observadas, muitos astrócitos se espalharam por toda a construção, apresentando morfologia astróctica e interconexão. A viabilidade celular foi avaliada logo após a bioimpressão e os resultados mostraram que, na velocidade mais baixa, as células viáveis representavam até 74% do total das células, sendo significativamente maiores do que as células bioimpressionadas em maior velocidade.
A viabilidade dos astrócitos bioimpressados foi normalizada para astrócitos cultivados em 2D e os resultados indicaram que, no sétimo dia, os astrócitos bioimpressos tiveram significativamente maior viabilidade. Imediatamente após a bioimpressão, os astrócitos mostraram morfologia redonda e ensaio morto vivo. Após uma semana, os astrócitos se espalharam por toda a construção e apresentaram uma morfologia distinta das células, idêntica à cultura 2D.
Os astrócitos bioimpressados 3D foram caracterizados por imunofluorescência. Após sete dias de incubação na construção bioimpressora, foram observados astrócitos altamente densos com uma morfologia semelhante a uma estrela. As células astrócitos bioimpressas expressas os astrócitos específicos marcador gliais fibrillary acidic protein indica retenção de fenótipo astrócito após sete dias de bioimpressão, e esses resultados indicam que a composição da bioinkina forneceu um microambiente biocompatível para promover a adesão, disseminação e crescimento dos astrócitos.
A avaliação de genes específicos e marcadores celulares expressados pelos astrócitos bioimpressas forneceria evidências da função neuro tecido, como a reatividade do astrocito após estímulos específicos. Este protocolo abre caminho para a biofabização de estruturas neurogênicas mais complexas compostas de diferentes tipos de células em biomoléculas, permitindo a imitação de nichos neurogênicos específicos.
