هذا البروتوكول لإنتاج ناقلات AAV الفيروسية فعالة من حيث التكلفة وتسفر عن نقاء عالية، تيتر عالية، AAV درجة البحوث لاستخدامها في نماذج حيوانية كبيرة قبل السريرية. تستخدم هذه التقنية خلايا HEK293 الملتصقة في غرف زراعة الخلايا ، وهي فعالة من حيث الوقت وأقل عملية ، مما يسمح باضطرابات أقل في الخلايا. يمكن أن يساعد هذا البروتوكول بشكل كبير في إنتاج ناقلات الفيروسات في مجال العلاج الجيني ، ويمكن استخدامه أيضا لإنتاج أنواع مصلية أخرى من AAV تربط أيضا كبريتات الهيباران.
للبدء، جمع خلايا HEK293 من الثقافة عندما تصل إلى التقاء 80٪. يستنشق وسائل الإعلام قبل غسل بلطف لوحة ثقافة الخلية مع ثلاثة ملليلتر من برنامج تلفزيوني. ثم يستنشق برنامج تلفزيوني وإضافة ثلاثة ملليلتر من التريبسين.
احتضان لوحات لمدة دقيقتين في 37 درجة مئوية. بعد الحضانة، تحييد التربسين، بإضافة سبعة ملليلتر من DMEM كاملة إلى لوحة، وجمع supernatant في 50 أنابيب مخروطية ملليلتر. عكس الأنابيب بلطف لضمان الخلايا متجانسة.
لتحديد كثافة الخلية، اخلط 10 ميكرولترات من عينات الخلية مع 10 ميكرولترات من أزرق التريبان. وإضافة الخليط إلى شريحة عد الخلايا لتحليل في عداد الخلية. مزيج تعليق الخلية مع لتر واحد من DMEM كاملة قبل تسخينها لرؤية غرفة الثقافة.
تدوير الغرفة بلطف لتوزيع الخلايا بالتساوي. احتضان الغرفة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بالإضافة إلى غرفة ثقافة الخلية، خلايا الثقافة في 10 إلى الخلايا الرابعة لكل سنتيمتر مربع في لوحة 15 سم كمرجع للالتقاء.
بعد 65 ساعة من الحضانة ، عندما تكون الخلايا التقاء 80 إلى 90 ٪، إضافة ببطء خليط البولي إيثيلينيمين الحمض النووي وDMEM في ميناء غرفة ثقافة الخلية. توزيع السائل بالتساوي على جميع الصفوف قبل احتضان في 37 درجة مئوية، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 72 ساعة. بعد الحضانة، هز غرفة ثقافة الخلية بقوة لطرد الخلايا حتى تظهر الوسائط غائمة، وصبها في أربعة أو 500 أنبوب طرد مركزي ملليلتر.
بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 18، 000 مرة G لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية. صب supernatant أوضح في زجاجة PETG لتر واحد، وإعادة إنفاق الكريات الخلية في 50 ملليلتر من العازلة المرخصة في أنابيب الطرد المركزي 500 ملليلتر. احتضان الأنابيب لمدة 60 دقيقة في 37 درجة مئوية.
بعد الحضانة، طرد الأنابيب في 18، 000 مرة G لمدة 30 دقيقة، ونقل supernatant في نفس زجاجة PETG لتر واحد. يخزن عند ناقص 80 درجة مئوية. إذابة lysate الخام في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.
بمجرد إذابته، قم بتصفية ذلك باستخدام فلتر 0.22 ميكرون. قبل خطوات التنقية مباشرة، قم بتفعيل المكثف الطردي المركزي بإضافة أربعة ملليلترات من حاجز المعالجة المسبقة للمرشح لكل عمود من أعمدة الهيبارين-سيفاروز المستخدمة. ضع الأنابيب في مضخة معج.
تشغيل الحلول والوسائط بشكل تسلسلي. الاستعداد للكروماتوغرافيا عن طريق إرفاق عمود الهيبارين سيباروز خمسة ملليلتر إلى الأنابيب، وتشغيل 25 ملليلتر من Bazell DMEM من خلال العمود. ثم تحميل 0.2 ميكرومولار من lysate الخام المصفاة على العمود بمعدل تدفق من 1 إلى 2 قطرات في الثانية الواحدة.
اغسل العمود بالتسلسل إلى 5 ملليلترات خمس مرات مع 300 ملليمولار من كلوريد الصوديوم HBSS ، مع المغنيسيوم والكالسيوم ، وتسمية elutions الخمسة E1 إلى E5. عندما تكون جاهزة، تدور مركز الطرد المركزي التي تحتوي على العازلة قبل المعالجة في 900 مرة G لمدة دقيقتين. تجاهل التدفق من خلال. اغسل فلتر المكثف الطرد المركزي بأربعة ملليلترات من HBSS بالمغنيسيوم والكالسيوم عن طريق الدوران عند 1000 مرة G لمدة دقيقتين.
ثم أضف elution E2 إلى المكثف الطرد المركزي، وتدور في 1000 مرة G لمدة خمس دقائق. تجاهل التدفق من خلال. وبالمثل تدور elution E3 في مركز الطرد المركزي حتى الفيروس المركز هو ما يقرب من ملليلتر واحد.
إزالة الفيروس المركز من مركز الطرد المركزي باستخدام طرف P200 المصفاة، وجمعه في أنبوب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر معقمة. بعد جمع الفيروس، شطف المكثف الطرد المركزي مع 200 ميكرولتر من HBSS مع المغنيسيوم والكالسيوم. ماصة صعودا وهبوطا بقوة لمدة 30 ثانية لطرد أي فيروس تلتزم الغشاء، وجمع الفيروس المركزة في نفس أنبوب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر.
خلط أنبوب جيدا. غسل العمود وتشبع مع 20٪ الإيثانول قبل تخزينها في أربع درجات مئوية. تخزين أنابيب مضخة في هيدروكسيد الصوديوم الأضراس واحد.
تمت مقارنة كفاءة نقل كابسيد AAV6.2FF في الفئران والهامستر والحملان لمدة 28 يوما عند الإدارة العضلية. الفئران تدار خمسة أضعاف 10 إلى الجينوم ناقلات 12th لكل كيلوغرام من AAV6.2FF IgG الإنسان، وأعرب عن ما بين 171 إلى 237 ميكروغرام لكل ملليلتر من IgG الإنسان في المصل. يتم إعطاء الهامستر في مرتين 10 إلى الجينوم ناقلات 13th لكل كيلوغرام من AAV6.2FF IgG الإنسان، وأعرب عن مستويات أعلى بكثير من IgG الإنسان من الفئران.
في حين أن نموذج الحيوان الكبير كان قادرا على التعبير عن متوسط 35 ميكروغرام لكل ملليلتر من مستويات IgG البشرية في البلازما. يمكن للنماذج الحيوانية الكبيرة تحديد التعبير عن المتحول AAV في الجسم الحي ، وتحديد ما إذا كان للمتحولات تأثير علاجي ضد الاضطراب أو المرض المثير للاهتمام. وقد أظهرت الدراسة قدرة كبيرة على النقل من AAV6.2FF، رواية AAV 6 ناقلات النمط المصلي في العضلات الهيكل العظمي، فضلا عن انخفاض المناعة من ناقلات الفيروسية AAV في الجسم الحي.
