وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المجلس الوطني للبحوث الطبية ، وسنغافورة.

1. الكسا فلور توسيم فيروس حمى الضنك <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رد الفعل قبل وضع العلامات ، وتنقية فيروس حمى الضنك مع وسادة السكروز وتحضير الكواشف والمعدات اللازمة كما هو مبين في البروتوكول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعداد جديدة بيكربونات الصوديوم 0.2M العازلة ، ودرجة الحموضة 8.5 (الوسم العازلة) ، وهيدروكسيل 1.5M العازلة ، ودرجة الحموضة 8.3 (وقف كاشف) ، قبل وضع العلامات وتصفية تعقيم المحاقن مع مرشحات 0.2μm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع وحدات اللوحة حوالي 8 تشكيل 3x10 (pfu) من فيروس حمى الضنك في تنقية 1ml وضع العلامات الفاصلة في أنبوب 2ml. يمكن تحجيم هذا الأمر نسبيا لوضع العلامات دفعة من الفيروس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تشكيل مجفد اليكسا فلور 594 (AF594) استرات succinimidyl ل1MM العازلة في وضع العلامات على الفور رد فعل من قبل لوضع العلامات. ويمكن استخدام fluorochromes أخرى من سلسلة اليكسا صبغ فلور وفقا لاحتياجات واحد. تقليل التعرض للضوء من هذه الخطوة فصاعدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100μl الصبغة AF594 1MM للفيروس مخفف مع التحريك بلطف مع طرف ماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان مزيج التفاعل العلامات في درجة حرارة الغرفة ل1hr في الظلام. مزيج لطيف من قبل كل ظاهرة الانقلاب 15mins. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتدور في فترة وجيزة في أنبوب جهاز طرد مركزي منضدية وإضافة 100μl من كاشف وقف إلى مزيج التفاعل مع التحريك بلطف مع طرف ماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة إضافية في الظلام. مزيج لطيف من قبل كل ظاهرة الانقلاب 15mins. </li></ol> 2. المسمى تنقية فيروس حمى الضنك اليكسا فلور <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في غضون ذلك ، تتوازن مع العمود تنقية العازلة في الاختيار. في هذه التجربة ، عمود PD - 10 غير المتوازنة مع 25ml من HNE العازلة (Hepes 5mm ، و 150mM كلوريد الصوديوم ، 0.1mM EDTA) ، ودرجة الحموضة 7.4 ، قبل الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ينطبق هذا الفيروس المسمى إلى أعلى العمود والبدء في جمع من خلال تدفق مرة يدخل الفيروس المسمى المصفوفة. ملء العمود مع العازلة HNE مرة واحدة فقط عن الفيروس المسمى دخلت المصفوفة. تجاهل 2.5ml الأولى من خلال تدفق وجمع 2ml القادم من الفيروس المسمى الكسر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة تنقية وتخزين AF594 فيروس حمى الضنك في المسمى -80 درجة مئوية ، بعيدا عن مصدر الضوء. </li></ol><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أذاب one قسامة وتحديد عيار من الفيروس المسمى بواسطة فحص اللوحة قبل استخدام دفعة من الفيروس المسمى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور 5x10 4 في خلايا فيرو جيدا ، ونمت في M - 199 متوسطة النمو ، في صفيحة 4 - جيدا مع ساترة على الجزء السفلي من يوم جيدا قبل العدوى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف الثقافة بشكل جيد وتصيب الخلايا مع تعدد الإصابة 1 من الفيروس المسمى في حجم 100μl (مخفف في M - 199 متوسطة الصيانة على النحو المطلوب) ل10min عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة اللقاح ، ويغسل مرتين في coverslips 1xPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الخلايا في paraformalydehyde 3 ٪ لل30mins. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل coverslips 3 مرات في 1xPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize الخلايا بمحلول يحتوي سابونين permeabilization 0.1 ٪ و 5 ٪ في جيش صرب البوسنة ل1xPBS 30mins. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا مع مخفف الطرد المركزي ، أوضح طاف من 3H5 ضد وحيد النسيلة للثقافة ورم هجين 1hr في غرفة رطبة ، محمية من الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل coverslips 3 مرات في غسل العازلة (1xPBS تحتوي على كلوريد الكالسيوم 1MM ، 1MM كلوريد المغنيسيوم و 0.1 سابونين ٪). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا مع AF488 مفتش الأضداد المضادة للماوس ، 1:100 مخففة في حل permeabilization ، ل45mins في غرفة رطبة ، محمية من الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل coverslips 3 مرات في غسل وشطف العازلة مرة واحدة في الماء منزوع الأيونات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الداب حافة ساترة ضد منشفة ورقية لتجفيف المياه الزائدة وجبل على لشريحة زجاجية مع 8μl Mowiol Dabco تحتوي على 4-88 2.5 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للمتصاعدة لوضع حل بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية قبل عرض باستخدام مجهر زايس مبائر. يجب أن يتم تنفيذ عمليات الاستحواذ متتابعة مثيرة one fluorophore في وقت واحد والتبديل بين كشف في نفس الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم تحليل الصور لتوطين المشارك للجسم تلطيخ E البروتين مع الفيروس المسمى باستخدام برنامج LSM زايس زن لتقدير درجة التوسيم. </li></ol> 3. ممثل النتائج ويرد مثال العائد من فيروس حمى الضنك المسمى مع AF594 صبغ في الشكل 2. عادة ، يجب أن تراعى أقل من 10 أضعاف قطرة من عيار الأولية التالية العلامات الناجحة. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن جميع المخازن يجب أن تكون على استعداد لوضع العلامات الجديدة لتكون ناجحة ، وينبغي أن تستخدم فلور اليكسا استرات succinimidyl فور إعادة كما يتحلل إلى أحماض مجانا متأخرا في المحاليل المائية 8. المقبل ، وهو الفيروس المسمى لابد من التحقق من مضان كافية قبل استخدامها في التجارب. وأجري الفحص المناعي على خلايا فيرو بسيطة ويمكن تقدير درجة من العلامات المشتركة لتوطين الفيروس المسمى مع E المضادة للبروتين تلوين الأجسام المضادة. قطعتم فحص خلايا القاعدة وتظهر صورة نموذجية مبائر في الشكل 3. شارك في توطين تحليل الصور باستخدام برنامج LSM زن أظهرت معاملات تداخل تتراوح ،65-0،8 ، مما يوحي بأن وصفت ما يقرب من 65 إلى 80 ٪ من virions مع الصبغة. <img src="/files/ftp_upload/3168/3168fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الرقم 1.Overall مخطط تصور وضع العلامات اليكسا صبغ فلور الداخلي فيروس حمى الضنك ، أولا ، على استعداد للمخازن ذات الصلة ، وتنقية فيروس حمى الضنك. وأعادت فلور اليكسا الأصباغ وإضافة إلى فيروس حمى الضنك مخففة في وضع العلامات العازلة. ثم توقفت ردود الفعل في وقت لاحق 1 ساعة مع إضافة كاشف تتوقف. بعد ذلك ، يتم تنقية الفيروس المسمى من خلال استبعاد حجم العمود لإزالة الصبغة الحرة. أخيرا ، هو الفيروس المسمى إعادة معاير التي مقايسة البلاك واختبارها لمضان. <img src="/files/ftp_upload/3168/3168fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. يعني عدد virions قابلة للحياة (pfu / مل) كما هو محدد على لوحة فحص قبل وبعد وضع العلامات AF594. إذابة هو أحد قسامة من الفيروس المسمى AF594 الضنك وإعادة معاير تلو فحص اللوحة وهذا يظهر عادة أقل من 10 أضعاف من الانخفاض من عيار البداية. أشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري التكرارات. <img src="/files/ftp_upload/3168/3168fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. أصيب شارك في توطين AF594 التسميات مع بروتينات فيروس حمى الضنك E في خلايا فيرو. coverslips الخلايا المزروعة في اليوم السابق مع AF594 الدنج في وزارة الداخلية المسمى من 1 لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية. وثبتت لاحقا إلى خلايا والمسمى مع E المضادة للأجسام المضادة ، ودرست لcolocalization من البروتين E (الأخضر) ، ووضع العلامات AF594 (الحمراء). وكانت إشارات تصور الفلورية تحت التكبير 63X باستخدام مجهر زايس LSM 710 مبائر. شريط المقياس 10μm. الأصفر تشير مجالات colocalization ، كما هو موضح في أقحم.

<ol>
	<li>Olenych, S. G., Claxton, N. S., Ottenberg, G. K. &. a. m. p. ;. a. m. p., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fluorescent+Protein+Color+Palette.">The Fluorescent Protein Color Palette.</a> Current Protocols in Cell Biology. 21.5, 1-34 (2007).</li><li>Panchuk-Voloshina, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alexa+dyes,+a+series+of+new+fluorescent+dyes+that+yield+exceptionally+bright,+photostable+conjugates.">Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates.</a> J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).</li><li>Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+fluorescent+protein+technology.">Advances in fluorescent protein technology.</a> J Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+use+of+fluorescent+protein+markers+in+living+cells.">Development and use of fluorescent protein markers in living cells.</a> Science. 300, 87-91 (2003).</li><li>Kuhn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+dengue+virus:+implications+for+flavivirus+organization,+maturation,+and+fusion.">Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion.</a> Cell. 108, 717-725 (2002).</li><li>Aguilar, J. S., Roy, D., Ghazal, P., Wagner, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimethyl+sulfoxide+blocks+herpes+simplex+virus-1+productive+infection+in+vitro+acting+at+different+stages+with+positive+cooperativity.+Application+of+micro-array+analysis.">Dimethyl sulfoxide blocks herpes simplex virus-1 productive infection in vitro acting at different stages with positive cooperativity. Application of micro-array analysis.</a> BMC Infect Dis. 2, 9-9 (2002).</li><li>Zhang, S. L., Tan, H. C., Hanson, B. J., Ooi, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+Alexa+Fluor+dye+labelling+of+dengue+virus.">A simple method for Alexa Fluor dye labelling of dengue virus.</a> J Virol Methods. 167, 172-177 (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Alexa Fluor Succinimidyl Esters (Molecular Probes. , (2009).</li><li>Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+proteins+stained+by+Alexa+dyes.">Analysis of proteins stained by Alexa dyes.</a> Electrophoresis. 25, 779-784 (2004).</li><li>Freistadt, M. S., Eberle, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+poliovirus+for+flow+cytometric+cell+surface+binding+studies.">Fluorescent poliovirus for flow cytometric cell surface binding studies.</a> J Virol Methods. 134, 1-7 (2006).</li></ol>

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

على الرغم من أن استخدام صبغة AF594 في هذا التقرير ، مجموعة واسعة من fluorophores في سلسلة فلور اليكسا استرات succinimidyl يتوفر مع العلامات الكيمياء مماثلة. ويمكن توسيع نطاق تطبيق هذا الوسم خارج التصوير. يمكن أن تستخدم التدفق الخلوي كبديل للمبائر المجهري لتقدير درجة لوسم fluorophores ال...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليقات (اختياري) </th></tr><tr><td> بيكربونات الصوديوم </td><td> سيغما الدريخ </td><td> S6297 </td><td></td></tr><tr><td> هيدروكسيل </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 159417 </td><td></td></tr><tr><td> هيدروكسيد الصوديوم </td><td> ميرك </td><td> 106498 </td><td></td></tr><tr><td> AF594 استرات succinimidyl </td><td> المسابر الجزيئية ، Invitrogen </td><td> A20004 </td><td></td></tr><tr><td> PD - 10 عمود </td><td> جنرال إلكتريك للرعاية الصحية </td><td> 17-0851-01 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> سيغما الدريخ </td><td> H6147 </td><td></td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> سيغما الدريخ </td><td> S3014 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> سيغما الدريخ </td><td> E9884 </td><td></td></tr><tr><td> M - 199 </td><td> Invitrogen </td><td> 11150 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03 </td><td></td></tr><tr><td> 4 كذلك لوحة </td><td> نونك </td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td> Coverslips </td><td> Einst </td><td> 0111520 </td><td></td></tr><tr><td> شريحة المجهر </td><td> الشراع العلامة التجارية </td><td> 7105 </td><td></td></tr><tr><td> 3H5 ورم هجين </td><td> ATCC </td><td> HB46 </td><td></td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> 1 قاعدة </td><td> BUF - 2040 - 10X1L </td><td></td></tr><tr><td> سابونين </td><td> سيغما الدريخ </td><td> S4521 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> سيغما الدريخ </td><td> A7906 </td><td></td></tr><tr><td> كلوريد المغنيسيوم </td><td> سيغما الدريخ </td><td> M2670 </td><td></td></tr><tr><td> كلوريد الكالسيوم </td><td> سيغما الدريخ </td><td> C3306 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehye </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 15،812-7 </td><td></td></tr><tr><td> Mowiol 4-88 </td><td> Calbiochem </td><td> 475904 </td><td></td></tr><tr><td> Dabco </td><td> سيغما الدريخ </td><td> D27802 </td><td></td></tr><tr><td> منضدية الطرد المركزي </td><td> إيبندورف </td><td> 5424 </td><td></td></tr><tr><td> مبائر المجهر </td><td> زايس </td><td> LSM 710 </td><td></td></tr></tbody></table> لإعداد M - 199 متوسطة النمو ، إضافة 50ml من FBS ، 5ml من البيروفات الصوديوم و5ml من غير الضروري من الأحماض الأمينية إلى 500ml من طراز M - 199 ، تصفية العقيمة. لإعداد M - 199 متوسطة الصيانة ، إضافة 15ml من FBS ، 5ml البيروفات من الصوديوم و5ml من غير الضروري من الأحماض الأمينية إلى 500ml من طراز M - 199 ، تصفية العقيمة.

visualizing dengue virus through alexa fluor labeling

يمكن للأحداث في وقت مبكر من التفاعل بين الفيروس والخلية لها تأثير عميق على نتيجة العدوى. ويمكن تحديد العوامل التي تؤثر على هذا التفاعل يؤدي إلى تحسين فهم المرض والتسبب بالتالي التأثير على تصميم أو لقاح علاجي. وبالتالي ، فإن تطوير وسائل لتحقيق هذا التفاعل مفيدا. ويمكن استغلال التطورات الأخيرة في التنمية fluorophores 1-3 و تكنولوجيا التصوير 4 إلى تحسين معرفتنا الحالية على المرضية بحمى الضنك ، وبالتالي تمهيد الطريق للحد من الملايين من الإصابات بحمى الضنك التي تحدث سنويا. فيروس حمى الضنك يلفها له سقالة الخارجية التي تتكون من dimers المغلف 90 (E) بروتين سكري حماية قذيفة nucleocapsid ، الذي يحتوي على حبلا واحدة إيجابية رنا الجينوم 5. وبالتالي يمكن أن مفارز متطابقة البروتين على سطح الفيروس يكون المسمى مع صبغة an رد الفعل من خلال تصور وأمين المجهري مناعي. هنا ، نقدم طريقة بسيطة لوضع العلامات لفيروس حمى الضنك مع اليكسا فلور succinimidyl استر الصبغة الذائبة مباشرة في بيكربونات الصوديوم العازلة التي أسفرت عن الفيروس مجدية للغاية بعد وضع العلامات. لا توجد إجراءات موحدة لوضع العلامات على فيروسات حية والبروتوكول الصانع القائمة لوضع العلامات البروتين وعادة ما يتطلب إعادة تشكيل الصبغة في سلفوكسيد ثنائي ميثيل. وجود ثنائي ميثيل سلفوكسيد ، حتى بكميات صغيرة ، يمكن منع العدوى من فيروس الإنتاجية وتحفز أيضا السمسة 6 خلايا. استبعاد استخدام سلفوكسيد ثنائي ميثيل في هذا البروتوكول وبالتالي تقليل هذا الاحتمال. الكسا الأصباغ فلور وصمود للضوء متفوقة ودرجة الحموضة أقل حساسة من الأصباغ المشتركة ، مثل فلوريسئين ورودامين 2 ، مما يجعلها مثالية لإجراء دراسات عن امتصاص الخلوية والنقل endosomal الفيروس. لم اقتران اليكسا فلور صبغة لا يؤثر على الاعتراف الفيروس المسمى بفيروس حمى الضنك ، ومستقبلات محددة الأضداد المفترضة لها في الخلايا المضيفة 7. هذا الأسلوب يمكن أن تكون لها تطبيقات مفيدة في الدراسات الفيروسية.

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling at JoVE.com

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

الاستفادة من التقدم في مجال التنمية وfluorophore تكنولوجيا التصوير ، وهي طريقة بسيطة لوضع العلامات اليكسا فلور من حمى الضنك ولقد ابتكر الفيروس لتصور التفاعلات المبكرة بين الفيروس والخلية.

تصور فيروس حمى الضنك من خلال وصفها اليكسا فلور

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

visualizing-dengue-virus-through-alexa-fluor-labeling

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.7K Views.  DSO National Laboratories. الاستفادة من التقدم في مجال التنمية وfluorophore تكنولوجيا التصوير ، وهي طريقة بسيطة لوضع العلامات اليكسا فلور من حمى الضنك ولقد ابتكر الفيروس لتصور التفاعلات المبكرة بين الفيروس والخلية.

Video: Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

عزل وتحليل العدلة لتحديد ما دورها في الغدد اللمفاوية حساسية الخلية وكلاء العلاجية

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

تقييم فعالية وسمية الرنا استهداف HIV-1 الإنتاج للاستخدام في الجينات أو العلاج بالعقاقير

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

إنقاذ وتوصيف الفيروسات المؤتلف من عالم جديد زيكا الفيروسات استنساخ العدوى

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal microscopy methods to visualize macrophage extracellular traps (METs). These extracellular traps are defined by the presence of extracellular chromatin with co-expression of other components such as granule proteases, citrullinated histones, and peptidyl arginase deiminase (PAD). The expression of METs is generally measured after exposure to a stimulus and compared to un-stimulated samples. Samples are also included for background and isotype control. Cells are analyzed using well-defined image analysis software. Confocal microscopy may be used to define the presence of METs both in vitro and in vivo in lung tissue.

Macrophage extracellular traps are a newly described entity. This article will concentrate on confocal microscopy methods and how they are visualized in vitro and in vivo from lung samples.

تصور بلعم الفخاخ خارج الخلية باستخدام المجهر [كنفوكل]

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity of antibodies or serum to enhance infection in impermissible cell lines have relied on using viral output in the media followed by plaque assays to quantify infection. More recently, these assays have examined Dengue virus (DENV) infection in the cell lines using fluorescently labeled antibodies. Both these approaches have limitations that restrict the widespread use of these techniques. Here, we describe a simple in vitro assay using Dengue virus reporter viral particles (RVPs) that express green fluorescent protein and K562 cells to examine antibody dependent enhancement (ADE) of DENV infection using serum that was obtained from rhesus macaques 16 weeks after infection with Zika virus (ZIKV). This technique is reliable, involves minimal manipulation of cells, does not involve the use of live replication competent virus, and can be performed in a high throughput format to get a quantitative readout using flow cytometry. Additionally, this assay can be easily adapted to examine antibody dependent enhancement (ADE) of other flavivirus infections such as Yellow Fever virus (YFV), Japanese Equine Encephalitis virus (JEEV), West Nile virus (WNV) etc. where RVPs are available. The ease of setting up the assay, analyzing the data, and interpreting results makes it highly amenable to most laboratory settings.

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

We describe a simple and easy protocol for measuring antibody dependent enhancement of infection by Zika virus convalescent serum using Dengue virus Reporter Viral Particles.

قياس تدفق بسيط على أساس التحليل تحديد في المختبر جسم تعزيز التابعة لفيروس حمى الضنك باستخدام مصل فيروس Zika النقاهة

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

استخراج سريعة وآمنة وبسيطة دليل السرير الحمض النووي للكشف عن الفيروس في عينات الدم كله

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in research laboratories, as well as for molecular diagnosis, because of its sensitivity, specificity, and convenience. However, in most cases, the quantitative PCR (qPCR) assay generally used to detect virus infection has relied on the purification of viral nucleic acid prior to the PCR step. In this study, the fluorescence-based reverse transcription qPCR (RT-qPCR) assay is developed through the combination of a processing buffer and a one-step RT-PCR reagent so that the whole process, from the harvest of the culture supernatant of virus-infected cells until real-time detection, can be performed without viral RNA purification. The established protocol enables the quantification of a wide range of RNA concentrations of dengue virus (DENV) within 90 min. In addition, the adaptability of the direct RT-qPCR assay to the evaluation of an antiviral agent is demonstrated by an in vitro experiment using a previously reported DENV inhibitor, mycophenolic acid (MPA). Moreover, other RNA viruses, including yellow fever virus (YFV), Chikungunya virus (CHIKV), and measles virus (MeV), can be quantified by direct RT-qPCR with the same protocol. Therefore, the direct RT-qPCR assay described in this report is useful for monitoring RNA virus replication in a simple and rapid manner, which will be further developed into a promising platform for a high-throughput screening study and clinical diagnosis.

Real-time quantitative polymerase chain reaction analysis combined with reverse transcription (RT-qPCR) has been widely used to measure the level of RNA virus infections. Here we present a direct RT-qPCR assay, which does not require an RNA purification step, developed for the quantification of several RNA viruses, including dengue virus.

قياس فيروس حمى الدنج الجيش الملكي النيبالي في المادة طافية الثقافة من الخلايا المصابة بسلسلة البلمرة الكمية في الوقت الحقيقي

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying gene expression related to biological processes of interest. These innovations not only allow researchers to observe expression from the mRNA sequences that code for genes that effect cellular function, but also the non-coding RNA (ncRNA) molecules that remain untranslated, but still have regulatory functions. Although researchers have the ability to observe both mRNA and ncRNA expression, it has been customary for a study to focus on one or the other. However, when studies are interested in both mRNA and ncRNA expression, many times they use separate samples to examine either coding or non-coding RNAs due to the difference in library preparations. This can lead to the need for more samples which can increase time, consumables, and animal stress. Additionally, it may cause researchers to decide to prepare samples for only one analysis, usually the mRNA, limiting the number of biological questions that can be investigated. However, ncRNAs span multiple classes with regulatory roles that effect mRNA expression. Because ncRNA are important to fundamental biologic processes and disorder of these processes in during infection, they may, therefore, make attractive targets for therapeutics. This manuscript demonstrates a modified protocol for the generation mRNA and non-coding RNA expression libraries, including viral RNA, from a single sample of whole blood. Optimization of this protocol, improved RNA purity, increased ligation for recovery of methylated RNAs, and omitted&#160;size selection, to allow capture of more RNA species.

Here, we present a protocol optimized for the processing of coding (mRNA) and non-coding&#160;(ncRNA) globin reduced RNA-seq libraries from a single whole blood sample.

وأعرب عن تحديد الترميز وفئات الحمض النووي الريبي غير الترميز في الخنازير الدم كله

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

A Murine Model of Dengue Virus-induced Acute Viral Encephalitis-like Disease

Dengue virus (DENV), an arthropod-borne virus transmitted by mosquitoes, may cause the severe disease known as dengue hemorrhagic fever, which is characterized by lethal complications due to plasma leakage, ascites, pleural effusion, respiratory distress, severe bleeding, and organ impairment. A few cases of DENV infection present neurological manifestations; however, studies have not explored DENV-induced neuropathogenesis further. In this study, we present a protocol to use an immunocompetent outbred ICR (Institute of Cancer Research) mouse for investigating the induction of central nervous system (CNS) infection with DENV, followed by the progression of acute viral encephalitis-like disease.

Here, we present a protocol for creating an immunocompetent ICR (Institute of Cancer Research) murine model of central nervous system infection to display the development of neuropathy. Monitoring acute viral encephalitic disorders by identical disease scores could be performed for showing dengue virus-induced neuropathy in vivo.

نموذج مورين من مرض التهاب الدماغ الفيروسي الحاد الناجم عن فيروس حمى الضنك

Dengue virus (DENV), an arthropod-borne virus transmitted by mosquitoes, may cause the severe disease known as dengue hemorrhagic fever, which is ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

في اختبار فيترو ELISA لتقييم قوة لقاح داء الكلب

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...