وأيد نشر هذا المقال عن طريق منحة من مكتب البحوث في جامعة ولاية تينيسي. المؤلفان بالشكر إلى الجيل السابق من الطلاب والباحثين التي عملت على صقل هذه الإجراءات. وأيد البحوث من المنح المقدمة من مؤسسة العلوم الوطنية (NSF - 0851113 ، 0825405 ، وجبهة الخلاص الوطني ، جبهة الخلاص الوطني 0550485).

1. الفائق من مياه البحر لتوليد &quot;خالية من الفيروسات&quot; المياه (ويلهلم Poorvin 2001) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم جمعها من مياه البحر حوالي 20L / lakewater كما جو معقم و مطهر ممكن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غير متسلسل prefiltered المياه من خلال 142 ملم قطرها 0.8 البولي مرشحات ميكرومتر التي يمكن الاحتفاظ بها في -20 درجة مئوية لتحليل المجتمع. ويمكن استخدام مرشحات أكبر حجم المسام قبل هذه الخطوة لأنظمة مثمرة للغاية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحصول على المياه ultrafiltered من نظام M12 Amicon (ميليبور) يستخدم لمدة 30 خرطوشة دوامة كيلو دالتون ، قطع لاستبعاد كل الفيروسات ، وحتى الصغيرة فيروسات الحمض النووي الريبي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتم معالجة العينات وتتركز في سرعة ~ 25 ٪ مع باسكال 15-16 ~ من الضغط الخلفي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسوف تبقى من العينة 500 مل من الماء ~ تحتوي على الفيروس يتركز المجتمع (والتي يمكن حفظها لتجارب أخرى) ، في حين سيتم استخدام ما تبقى من 19.5 لتر من المياه للفيروسات مجانا للفحوصات الإنتاج الفيروسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد كل يوم من الاستخدام ، يجب تنظيف M12 Amicon نظام لمنع تلف الغشاء من خرطوشة فلتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كنت تعمل مع مياه البحر ، وشطف الغشاء بها مع ما لا يقل عن 6L من الملة - Q المياه يليه الغسيل بمحلول هيدروكسيد الصوديوم 0.1N عن 30-45 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف مرة أخرى مع خرطوشة على الأقل من الملة 6L - Q المياه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند الانتهاء من استخدام نظام M12 ، ينبغي تخزين خرطوشة في دوامة 0.05MH 3 ص 4 حل في 4 درجات مئوية. </li></ol> 2. فيروس أسلوب الحد لإنتاج الفيروسي (فيلهلم وآخرون 2002) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يصل الى 500 مل من العينة مياه البحر / lakewater مع الحصول على كل من الدول المضيفة والفيروسات وضعت في وحدة sterifilter مع انخفاض 0.2 ميكرومتر مسام الحجم الاسمي البروتين الملزمة تصفية (على سبيل المثال ، Durapore) الملقاة على عاتقها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبلطف ضغط على فراغ العينة 200 مم زئبق &lt;إعادة التعليق في حين باستمرار العينة باستخدام ماصة معقمة لمنع نقل خلايا بكتيرية من التركيز على تصفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ببطء تضاف ثلاثة مجلدات من رشاحة مستدقة إلى تعليق البكتيرية لخفض كبير في عدد الفيروسات مجانا في العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتضعف البكتيريا مرة أخرى إلى كسر 500 مليلتر من الماء للفيروس مجانا ، وتنقسم إلى ثلاثة مكررات من كل 150 مل وتوضع في زجاجات البولي واضحة 250ml. </li></ol> 3. تدفق الترشيح عرضية (TFF) طريقة لإنتاج الفيروسي (Weinbauer وآخرون 2002 ، Winget وآخرون ، 2005) TFF يمثل نهجا بديلا لأسلوب الحد الفيروسية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم جمع ما يقرب من 500 مليلتر من العينة الطبيعية على النحو المبين أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتتركز هذه العينة باستخدام 0.2 ميكرومتر الاسمية مسام حجم تدفق الترشيح عرضية النظام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما يتم تقليل نسبة البكتيريا إلى حوالي 10-15 مل ، يضاف ultrafiltered ، خالية من الفيروسات المياه وتوزيعها على النحو الوارد أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تحضين الزجاجات تكرار في الوضع الطبيعي في ظل ظروف استخدام غرف البيئية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تغيير مستويات الضوء على ظروف السطح باستخدام زرقاء ملون الاكريليك الاكريليك أو الفرز واضحة مع انخفاض صافي شدة الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غالبا ما يتم الحصول على درجات حرارة سطح المحيط باستخدام مياه البحر تتدفق على سطح السفينة الحاضنة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتؤخذ عينات لتقديرات وفرة البكتيرية والفيروسية في وقت 0 مع التركيز النهائي للغلوتارالدهيد العقيمة 2،0-2،5 ٪ تضاف الى cryovials. وعلى الفور هذه العينات فلاش المجمدة مع النيتروجين السائل وتخزينها مجمدة حتى معالجتها. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اذا النيتروجين السائل لا يتوفر ، قد تكون على استعداد الشرائح المجهرية ومعالجتها فورا (انظر الإجراء أدناه) </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم جمع العينات الفرعية كل ساعة 2.5 لا يقل عن 10 ساعة من الطريقة الموصوفة أعلاه. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربما في هذا الوقت يتم جمع المياه للتحليل PCR الكمي. ويمكن إضافة ما يصل إلى 5 مل من العينة إلى cryovial مع عدم وجود وكيل مثبت مع فلاش تجميد فوري في النيتروجين السائل. </li></ol></li></ol> 4. الفيروسية الميكروسكوب الإنتاج (وFuhrman نوبل عام 1998 ، ون جيا باو وآخرون 2004) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب إذابة العينات المجمدة لتكون 0.02 ميكرون ، تصفية للفحص المجهري على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل الأسهم الخضراء SYBR بواسطة تمييع الحل 1:10 الأسهم مع الماء المعقم. القادم من الحل الأوراق المالية ، وتعد حلا العمل بإضافة 1mL من محلول المخزون إلى 39 مل من الماء المعقم. وينبغي أيضا الجلسرين 50 ٪ ، 50 ٪ فوسفات مخزنة حلول المالحة (PBS ، 0.05 م 2 نا هبو 4 ، 0.85 ٪ كلوريد الصوديوم ، ودرجة الحموضة 7.5) والحل الطازجة 2.5 ٪ من الأسهم ف phenylenediamine يكون مستعدا قبل بداية. الحفاظ على 50 ٪ حل PBS glycerol/50 ٪ في 4 درجات مئوية وphenylenediam - Pالمعهد الوطني للإحصاء المخزون في -20 درجة مئوية في الظلام حتى تبدأ. الحق قبل التصفية إضافة ف phenylenediamine إلى 50 ٪ PBS glycerol/50 ٪ لتركيز النهائي من 0.1 ٪ لاستخدامه كحل Antifade. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 25 مم 0.02 ميكرون تصفية - Anodisc على رأس MicronStep - 0.45 ميكرون ، السليلوزية دعم مرشح. إضافة 850 ميليلتر من العينة ثابتة لأعلى Anodisc وفراغ في 20 الباكاف الحمضية حتى جفت تماما. مكان 100 ميكرولتر من محلول أخضر SYBR تعمل على طبق بتري معقمة و، مع فراغ لا يزال على إزالة بعناية Anodisc من برج تصفية ومكان على SYBR الخضراء. احتضان هذه العينات في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. إزالة بعناية مرشح من حل الخضراء SYBR الفتيل والجزء الخلفي من التصفية مع Kimwipe لإزالة كافة صبغ المتبقية. إذا رغبت في ذلك ، العودة إلى تصفية البرج وتمرير ما يصل الى 800 ميكرولتر من 0.02 ميكرون ، الماء المصفى أو وسائل الإعلام معقمة من خلال تصفية وصمة عار لشطف الزائدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة قطرة صغيرة من محلول antifade على شريحة المجهر ووضع غطاء على رأس زلة. إزالة الغطاء زلة وإضافة إلى تصفية المجفف الشريحة المجهر مبللة بمحلول antifade. مرة أخرى ، إضافة كمية صغيرة من محلول antifade زلة لتغطية ومكان ببطء على أعلى من مرشح ، مع التأكد من التخلص من أي الفقاعات التي قد تشكل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجمد على الفور الشرائح في -20 درجة مئوية لحين الحاجة إليها (وينبغي أن تستخدم هذه في غضون بضعة أشهر لمنع وخفض التهم يتلاشى الفيروس) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وترد الفيروسات باستخدام المجهر مضان (في حالتنا المجهر DMRXA ايكا) مع مجموعة واسعة تصفية الأزرق (λ = تحويلة 450-490 نانومتر ، λ = 510 نانومتر إم مع مرشح في قمع λ = 510 نانومتر). سيقوم كل مرشح على الأقل 20 حقول نظر عدها ، والتأكد من أن كمية الفيروسات من مجموع كل شبكة الميدانية لضمان توزيع عادل للفيروسات عبر غشاء التصفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبلغ متوسط ​​معدلات من تكرار الفيروس من المستقلين three متماثلة ومن ثم تحسب ويتم تحديد الانحراف المعياري من معدلات الإنتاج. </li></ol> 5. ممثل النتائج البيانات الأولية التي جمعها الباحث يتطلب الحد الأدنى من المعالجة الحسابية لتوليد معدلات تكرار وفرة الفيروس. مجموعة البيانات الأولية الناتجة عن هذه الدراسة هي معدلات تكرار وفرة الفيروس في العينات الفرعية من حضانات. هذه النتائج شكل انحدارات مستقلة وفرة الوقت ضد الفيروسات لكل من العينات. لكل عينة حضانات الفردية بمثابة علاج واحد ، حتى قبل إنجاز ثلاث نسخ ، الباحث حضانات يمكن حساب معدلات وكذلك تقدير الاختلاف (على سبيل المثال ، الانحراف المعياري) (انظر الشكل 1). التحذير واحدة من هذه العملية هو أن الحد من وفرة في الثوابت الفيروس يؤدي إلى انخفاض في الخلايا المضيفة في العينة التي تحمل عبء الفيروس. للتعويض عن هذه الخسارة ، والعد من وفرة من مصدر البكتيريا على السواء (فلتر مياه البحر أو مياه البحيرة) و= T عينة حضانة 0 ضرورية. ويمكن استخدام هذه المعلومات لحساب النسبة المئوية من الخلايا المفقودة : على افتراض أن عملية الحد من وفرة الفيروس ليس انتقائيا لصالح أو ضد أي من أفراد المجتمع الجرثومية ، ويمكن بعد ذلك أن هذا العامل يمكن استخدامها لتقدير معدل الإنتاج في الموقع من الفيروسات . <img src="/files/ftp_upload/2196/2196fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. وقد تم جمع عينات من إنتاج الفيروسات مثل الجزيئات على مدى 10 ساعة في الحضانة في ظروف الموقع باستخدام المجهر epifluorescence. العوالق النباتية خلال ازهر قبالة سواحل نيوزيلندا في شهر سبتمبر من عام 2008. <img src="/files/ftp_upload/2196/2196fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. رسم تخطيطي للعملية تدفق العمل لمعايرة الانتاج الفيروس. تبدأ العملية مع الفائق عينة من المياه لتوليد المياه خالية من الفيروسات. اكتمال هذا باستخدام نظام الترشيح الفائق. في عينات المياه موازية يتم جمعها من نفس الموقع والفيروسات حرة مرت من خلال مرشح في حين يتم الاحتفاظ المجتمع الميكروبية (التي تحتوي على خليط من الخلايا المصابة وغير المصابة). هو معلق ثم هذا المجتمع في الماء فيروس مجانا وحضنت تحت ظروف الموقع. ثم يتم رصد معدل تكرار الفيروسات للساعات ال 10 المقبلة لتحديد معدلات إنتاج الفيروس.

<ol>
	<li>Higgins, J. L., Kudo, I., Nishioka, J., Tsuda, A., Wilhelm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+response+of+the+virus+community+to+a+mesoscale+iron+fertilization+in+the+sub-Arctic+Pacific+Ocean.">The response of the virus community to a mesoscale iron fertilization in the sub-Arctic Pacific Ocean.</a> Deep-Sea Res II. 56, 2788-2795 (2009).</li><li>Mioni, C. E., Poorvin, L., Wilhelm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+and+siderophore-mediated+transfer+of+available+Fe+between+heterotrophic+bacteria:+characterization+using+a+Fe-specific+bioreporter.">Virus and siderophore-mediated transfer of available Fe between heterotrophic bacteria: characterization using a Fe-specific bioreporter.</a> Aquat Microb Ecol. 41, 233-245 (2005).</li><li>Noble, R. T., Fuhrman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+SYBR+Green+I+for+rapid+epifluorescence+counts+of+marine+viruses+and+bacteria.">Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria.</a> Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).</li><li>Parada, V., Herndl, G., Weinbauer, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+burst+size+of+heterotrophic+prokaryotes+in+aquatic+systems.">Viral burst size of heterotrophic prokaryotes in aquatic systems.</a> J Mar Biol Assoc U K. 86, 613-621 (2006).</li><li>Poorvin, L., Rinta-Kanto, J. M., Hutchins, D. A., Wilhelm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+release+of+Fe+and+its+bioavailability+to+marine+plankton.">Viral release of Fe and its bioavailability to marine plankton.</a> Limnol Oceanogr. 49, 1734-1741 .</li><li>Rowe, J. M., Saxton, M. A., Cottrell, M. T., DeBruyn, J. M., Berg, G. M., Kirchman, D. L., Hutchins, D. A., Wilhelm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constraints+on+virus+production+in+the+Sargasso+Sea+and+North+Atlantic.">Constraints on virus production in the Sargasso Sea and North Atlantic.</a> Aquat Microb Ecol. 52, 233-244 (2008).</li><li>Weinbauer, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecology+of+prokaryotic+viruses.">Ecology of prokaryotic viruses.</a> FEMS Microbiol Rev. 28, 127-181 (2004).</li><li>Weinbauer, M. G., Peduzzi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency,+size+and+distribution+of+bacteriophages+in+different+marine+morphotypes.">Frequency, size and distribution of bacteriophages in different marine morphotypes.</a> Mar Ecol Prog Ser. 108, 11-20 (1994).</li><li>Weinbauer, M. G., Winter, C., H&amp;ouml, f. l. e., G, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconsidering+transmission+electron+microscopy+based+estimates+of+viral+infection+of+bacterioplankton+using+conversion+factors+derived+from+natural+communities.">Reconsidering transmission electron microscopy based estimates of viral infection of bacterioplankton using conversion factors derived from natural communities.</a> Aquat Microb Ecol. 27, 103-110 (2002).</li><li>Wen, K., Ortmann, A. C., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+estimation+of+viral+abundance+by+epifluorescence+microscopy.">Accurate estimation of viral abundance by epifluorescence microscopy.</a> Appl Environ Microbiol. 70, 3862-3867 (2004).</li><li>Wilhelm, S. W., Brigden, S. M., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dilution+technique+for+the+direct+measurement+of+viral+production:+a+comparison+in+stratified+and+tidally+mixed+coastal+waters.">A dilution technique for the direct measurement of viral production: a comparison in stratified and tidally mixed coastal waters.</a> Microb Ecol. 43, 168-173 (2002).</li><li>Wilhelm, S. W., Matteson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freshwater+and+marine+virioplankton:+a+brief+overview+of+commonalities+and+differences.">Freshwater and marine virioplankton: a brief overview of commonalities and differences.</a> Freshw Biol. 53, 1076-1089 (2008).</li><li>Wilhelm, S. W., Poorvin, L., Paul, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Quantification of algal viruses in marine samples. , 53-66 (2001).</li><li>Wilhelm, S. W., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viruses+and+nutrient+cycles+in+the+sea.">Viruses and nutrient cycles in the sea.</a> Bioscience. 49, 781-788 (1999).</li><li>Wilhelm, S. W., Weinbauer, M. G., Suttle, C. A., Jeffrey, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+sunlight+in+the+removal+and+repair+of+viruses+in+the+sea.">The role of sunlight in the removal and repair of viruses in the sea.</a> Limnol Oceanogr. 43, 586-592 (1998).</li><li>Winget, D. M., Williamson, K. E., Helton, R. R., Wommack, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tangential+flow+diafiltration:+an+improved+technique+for+estimation+of+virioplankton+production.">Tangential flow diafiltration: an improved technique for estimation of virioplankton production.</a> Aquat Microb Ecol. 41, 221-232 (2005).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وثمة عنصر حاسم في فهم كيفية تأثير الفيروسات المجتمعات الميكروبية البحرية لتحديد المعدل الذي يتم إنتاج جسيمات الفيروس. بالنظر إلى أن الكميات المتوفرة هي (أكثر أو أقل) ثابتة في معظم أنظمة (ويلهلم Suttle 1999 ، Weinbauer 2004) ، وتتم إزالة تلك الفيروسات أو جعلها غير المعدية بسرعة في النظم المائية (ويلهلم وآخرون 1998) ، ثم يجب أن تكون معدلات الإنتاج النسبية السريع ليحل محل جزيئات المفقودة. تقدير معدل وفيات الفيروسات تتسبب في المجتمع الميكروبية يتطلب معرفة كيفية العديد من الفيروسات يتم إنتاجها في كل مرة فيروس lyses خلية (&quot;حجم الانفجار&quot;). يمكن أن تنفجر أحجام الفيروس في عينات طبيعية تختلف إلى حد كبير. ويمكن تحديد أحجام انفجر مباشرة انتقال المجهر الإلكتروني (على سبيل المثال ، وWeinbauer Peduzzi 1994) ، ولكن هذا غالبا ما يتجاوز قدرات مختبر معين ، أو ليست دائما عملية. في الحالات التي لا يمكن تحديدها تجريبيا ، يمكن استخدام قيم الأدب من 24 فيروسات في حال lytic للأنظمة البحرية و 34 لنظم المياه العذبة (بارادا وآخرون 2006). إذا تم تقسيم معدل إنتاج الفيروس عن طريق هذا الرقم ، والنتيجة هي وفرة من الخلايا لكل وحدة التخزين التي دمرتها الفيروسات على أساس يومي. ثم يمكن لهذه الميكروبات lysed تكون القيمة مقسوما على وفرة المخزون يقف الجرثومي مما أسفر عن وفيات الفيروس الناجم عن النظام في السؤال : تتراوح التقديرات الحالية في المئة من عدد قليل من السكان تقريبا كامل وغالبا ما تعتمد على عوامل أخرى في النظام في السؤال (ويلهلم وماتيسون 2008). لتحديد النسبة المئوية من مجموع الوفيات في كثير من الأحيان يتم ضرب هذا الرقم من قبل اثنين من (العمل من افتراض أن 50 ٪ من الخلايا تستمر في التكاثر ويتم فقدان 50 ٪ من الخلايا ، Weinbauer 2004). نظرا إلى أن المواد الغذائية وتتبع عنصر التوافر البيولوجي (على سبيل المثال ، N ، P ، الحديد) يمكن أن يحد من معدل الإنتاجية الأولية ، وكما تدفق الكربون من هذا القبيل ، من خلال النظم المائية ، وفهم دور وفيات فيروس يحركها الميكروبية في هذه العملية أصبحت تهم geochemists البحرية. وتوجد حاليا عدة تقديرات تشير إلى أن الفيروسات الافراج عن تركيزات كبيرة من العناصر الغذائية مرة أخرى إلى عمود الماء على أساس يومي (رو وآخرون 2008 ، هيغنز وآخرون 2009) والتي يتم استيعابها بسرعة هذه العناصر من قبل المجتمع الجرثومية (Poorvin وآخرون بن ، 2004 ، Mioni وآخرون 2005). ويمكن تحديد نسبة تدفق المواد الغذائية على البيئة عن طريق ضرب عدد الخلايا التي دمرها كمية من الخلايا في المغذيات (الرمز &quot;الحصص&quot;). ويمكن تقديم هذه المعلومات عنصرا حاسما في فهمنا للكيفية التي تعمل في شبكات الغذاء الجرثومية عبر النظم المائية. التطورات الجارية : الجهود الحالية لسلسلة من المجموعات البحثية تشمل التكيف مع الاستراتيجية المذكورة أعلاه لتعداد فيروسات محددة داخل المجتمع ، وعلى هذا النحو ، لتحديد كيفية تأثر الكائنات محددة من نشاط الفيروس. للقيام بذلك استخدم الباحثون سلسلة البلمرة الكمية التفاعل (qPCR) لتقدير وفرة من الجماعات فيروسات محددة أو الأسر في موازية لتقديرات المجتمع فيروس الكلي. ثم يتم تطبيق نتائج مباشرة لتقديم تقديرات لمعدل وفيات الفيروس ، ودوران المغذيات ، الخ العوالق للجماعات معينة. وهذا النهج قوية جديدة تسمح للباحثين في السنوات المقبلة لحفر أعمق بكثير في العمليات المرتبطة الفيروسات والايكولوجيا ، للمرة الأولى ، لقياس التفاعلات بين المجتمعات المضيفة للفيروسات محددة وراء القيود التي تفرضها النظم المختبرية.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>2.5% p-phenylenediamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Acros</td>
<td>130575000</td>
<td>Stock for Antifade</td>
</tr>
<tr>
<td>Amicon Proflux M12 system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>N/A</td>
<td>Any ultrafiltration device may be used for this step</td>
</tr>
<tr>
<td>SYBR Green I nucleic acid gel stain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>S-7563</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Helicon S10 30kDa Filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>CDUF010LT</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pelicon XL filters 0.22 &mu;m</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>PXGVPPC50</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GE 0.2 &mu;m PCTE membrane filters (47mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>09-732-35</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Millipore Labscale Tangential Flow Filtration System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>XX42LSS11</td>
<td>Other TFF systems may be used for this step</td>
</tr>
<tr>
<td>0.45 &mu;m Micronstep, Cellulosic, white plain filters (25mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>E04WP02500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GE Whatman 0.02 &mu;m Anodisc filters (25mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>68-09-6002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Leica DMRXA microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Any epifluorescence microscope with a blue filter set may be used</td>
</tr>
<tr>
<td>20L polycarbonate carboys</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP229-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS (0.05 M Na2HPO4, 0.85% NaCl, pH 7.5)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP329-500, S640-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50% Glutaraldehyde </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>G151-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Corning 2 mL Cryovials-External Thread polypropylene</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>09-761-71</td>
<td>Any cryovials may be used</td>
</tr>
<tr>
<td>Corning 5 mL Cryovials-External Thread polypropylene</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>09-761-74</td>
<td>Any cryovials may be used</td>
</tr>
<tr>
<td> 85% H3PO4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>A242-212</td>
<td>Spiral Membrane storage</td>
</tr>
<tr>
<td>NaOH pellets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>S318-3</td>
<td>M12 cleaning</td>
</tr>
<tr>
<td>Graduated Cylinders</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isopore 0.8-&mu;m pore-size membrane filter (142mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>ATTP14250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Millipore Stainless Steel Pressure Filter Holder (142mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>YY30 090 00</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

estimating virus production rates in aquatic systems

الفيروسات انتشارا هي مكونات النظم البحرية والمياه العذبة ، والمعروف أن وكلاء كبيرة من وفيات الميكروبية. وضع تقديرات كمية لهذه العملية أمر بالغ الأهمية لأننا يمكن أن تتطور ثم نماذج أفضل لهيكل المجتمع الميكروبية وظيفة فضلا عن تعميق فهمنا لكيفية عمل الفيروسات لتغيير دورات البيوجيوكيميائية المائية. تقنية تخفيض الفيروس يسمح للباحثين لتقدير السعر الذي يتم الافراج جزيئات الفيروس من المجتمع الميكروبية المتوطنة. باختصار ، هو انخفاض وفرة من الفيروسات (خارج الخلية) في عينة مجانية بينما يتم الحفاظ على تركيز المجتمع الميكروبية في المحيط القريب. ومن ثم حضنت المجتمع الميكروبية في غياب الفيروسات مجانا والمعدل الذي فيروسات تتكرر في العينة (من خلال تحلل أعضاء المصابة بالفعل للمجتمع) يمكن قياسها كميا بواسطة المجهر epifluorescence أو ، في حالة من فيروسات محددة ، والكمية PCR. ويمكن عندئذ أن تستخدم هذه المعدلات لتقدير معدل وفيات نتيجة لتحلل الميكروبي خلية الفيروس بوساطة.

Watch this Scientific Journal Video about Estimating Virus Production Rates in Aquatic Systems at JoVE.com

Estimating Virus Production Rates in Aquatic Systems

ويمكن تقدير معدل الدوران من الفيروسات في الأنظمة البحرية والمياه العذبة عن طريق الحد من تكرار وتقنية. البيانات تسمح للباحثين لاستنتاج معدلات وفيات فيروس الميكروبية التي تتوسط في النظم المائية.

تقدير معدلات الإنتاج الفيروسات في النظم المائية

Viruses are pervasive components of marine and freshwater systems, and are known to be significant agents of microbial mortality. Developing quantitative ...

estimating-virus-production-rates-in-aquatic-systems

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.5K Views.  University of Tennessee. ويمكن تقدير معدل الدوران من الفيروسات في الأنظمة البحرية والمياه العذبة عن طريق الحد من تكرار وتقنية. البيانات تسمح للباحثين لاستنتاج معدلات وفيات فيروس الميكروبية التي تتوسط في النظم المائية.

Video: Estimating Virus Production Rates in Aquatic Systems

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that influence this interaction could lead to improved understanding of disease pathogenesis and thus influence vaccine or therapeutic design. Hence, the development 
of methods to probe this interaction would be useful. Recent advancements in fluorophores development1-3 and imaging technology4 can be exploited to 
improve our current knowledge on dengue pathogenesis and thus pave the way to reduce the millions of dengue infections occurring annually.

The enveloped dengue virus has an external scaffold consisting of 90 envelope glycoprotein (E) dimers protecting the nucleocapsid shell, 
which contains a single positive strand RNA genome5. The identical protein subunits on the virus surface can thus be labeled with an amine reactive dye and visualized 
through immunofluorescent microscopy. Here, we present a simple method of labeling of dengue virus with Alexa Fluor succinimidyl ester dye dissolved directly in a sodium 
bicarbonate buffer that yielded highly viable virus after labeling. There is no standardized procedure for the labeling of live virus and existing manufacturer&#x2019;s protocol 
for protein labeling usually requires the reconstitution of dye in dimethyl sulfoxide. The presence of dimethyl sulfoxide, even in minute quantities, can block 
productive infection of virus and also induce cell cytotoxicity6. The exclusion of the use of dimethyl sulfoxide in this protocol thus reduced this possibility. 
Alexa Fluor dyes have superior photostability and are less pH-sensitive than the common dyes, such as fluorescein and rhodamine2, making them ideal for 
studies on cellular uptake and endosomal transport of the virus. The conjugation of Alexa Fluor dye did not affect the recognition of labeled dengue 
virus by virus-specific antibody and its putative receptors in host cells7. This method could have useful applications in virological studies.

Taking advantage of the advancements in fluorophore development and imaging technology, a simple method of Alexa Fluor labeling of dengue virus was devised to visualize the early interactions between virus and cell.

تصور فيروس حمى الضنك من خلال وصفها اليكسا فلور

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 which regulate the expression of non-structural (NS1 and NS2) and capsid proteins (VP1 and VP2) respectively1. They attract high interest as anticancer agents for their oncolytic and oncosuppressive abilities while being non-pathogenic for humans2. NS1 is the major effector of viral cytotoxicity3. In order to further enhance their natural antineoplastic activities, derivatives from these vectors have been generated by replacing the gene encoding for the capsid proteins with a therapeutic transgene (e.g. a cytotoxic polypeptide, cytokine, chemokine, tumour suppressor gene etc.)4. The recombinant parvoviruses (recPVs) vector retains the NS1/2 coding sequences and the PV genome telomeres which are necessary for viral DNA amplification and packaging. Production of recPVs occurs only in the producer cells (generally HEK293T), by co-transfecting the cells with a second vector (pCMV-VP) expressing the gene encoding for the VP proteins (Fig. 1)4. The recPV vectors generated in this way are replication defective. Although recPVs proved to possess enhanced oncotoxic activities with respect to the parental viruses from which they have been generated, their production remains a major challenge and strongly hampers the use of these agents in anti-cancer clinical applications.
We found that introduction of an Ad-5 derived vector containing the E2a, E4(orf6) and the VA RNA genes (e.g. pXX6 plasmid) into HEK293T improved the production of recPVs by more than 10 fold in comparison to other protocols in use. Based on this finding, we have constructed a novel Ad-VP-helper that contains the genomic adenoviral elements necessary to enhance recPVs production as well as the parvovirus VP gene unit5. The use of Ad-VP-helper, allows production of rec-PVs using a protocol that relies entirely on viral infection steps (as opposed to plasmid transfection), making possible the use of cell lines that are difficult to transfect (e.g. NB324K) (Fig. 2). We present a method that greatly improves the amount of recombinant virus produced, reducing both the production time and costs, without affecting the quality of the final product5. In addition, large scale production of recPV (in suspension cells and bioreactors) is now conceivable.

Here we describe a protocol based only on cell infection, which improves the efficiency of recombinant parvovirus production by more than 100 fold in comparison to other protocols in use. This protocol relies on the use of a novel adenovirus 5-based helper containing the parvovirus VP transcription unit (Ad-VP).

كفاءة الإنتاج البارفو المؤتلف مع مساعدة من اتش المستمدة من الأنظمة

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 ...

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by Russel and Burch in Hume's 3Rs (replacement, reduction, refinement), the utilization of animal models in scientific research is under constant pressure to identify new methodologies to reduce animal usage while improving scientific accuracy and speed. A major challenge to Hume's principals however, is how to ensure the studies are statistically accurate while reducing animal disease morbidity and overall numbers. Vaccine efficacy studies currently require a large number of animals in order to be considered statistically significant and often result in high morbidity and mortality endpoints for identification of immune protection. We utilized in vivo imaging systems (IVIS) in conjunction with a firefly bioluminescent enzyme to progressively track the invasion of the central nervous system (CNS) by an encephalitic virus in a murine model. Typically, the disease progresses relatively slowly, however virus replication is rapid, especially within the CNS, and can lead to an often, lethal outcome. Following intranasal infection of the mice with TC83-Luc, an attenuated Venezuelan equine encephalitis virus strain modified to expresses a luciferase gene; we are able to visualize virus replication within the brain at least three days before the development of clinical disease symptoms. Utilizing CNS invasion as a key encephalitic disease development endpoint we are able to quickly identify therapeutic and vaccine protection against TC83-Luc infection before clinical symptoms develop. With IVIS technology we are able to demonstrate the rapid and accurate testing of drug therapeutics and vaccines while reducing animal numbers and morbidity.

In Vivo Imaging Systems IVIS Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Utilizing luciferase and in vivo imaging systems (IVIS) as a novel means to identify disease endpoints before clinical developments occur. IVIS has allowed us to visualize in real time the invasion of encephalitic viruses over multiple days, providing a more accurate disease model for future study. It has also allowed us to identify the potential protective features of antivirals and vaccines faster than currently utilized animal models. The capability to utilize individual animals over multiple time points ensures reduced animal requirements, costs, and overall morbidity to the animals utilized ensuring a more humane and more scientific means of disease study.

في الجسم الحي التصوير كشفها (IVIS) نظم لفيروس العصبية الغازية ملتهب الدماغ

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

عزل وتحليل العدلة لتحديد ما دورها في الغدد اللمفاوية حساسية الخلية وكلاء العلاجية

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

مقاربة بسيطة وفعالة لبناء ناقلات الفيروسات المسخ الوقس

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

تقييم فعالية وسمية الرنا استهداف HIV-1 الإنتاج للاستخدام في الجينات أو العلاج بالعقاقير

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

استخراج سريعة وآمنة وبسيطة دليل السرير الحمض النووي للكشف عن الفيروس في عينات الدم كله

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying gene expression related to biological processes of interest. These innovations not only allow researchers to observe expression from the mRNA sequences that code for genes that effect cellular function, but also the non-coding RNA (ncRNA) molecules that remain untranslated, but still have regulatory functions. Although researchers have the ability to observe both mRNA and ncRNA expression, it has been customary for a study to focus on one or the other. However, when studies are interested in both mRNA and ncRNA expression, many times they use separate samples to examine either coding or non-coding RNAs due to the difference in library preparations. This can lead to the need for more samples which can increase time, consumables, and animal stress. Additionally, it may cause researchers to decide to prepare samples for only one analysis, usually the mRNA, limiting the number of biological questions that can be investigated. However, ncRNAs span multiple classes with regulatory roles that effect mRNA expression. Because ncRNA are important to fundamental biologic processes and disorder of these processes in during infection, they may, therefore, make attractive targets for therapeutics. This manuscript demonstrates a modified protocol for the generation mRNA and non-coding RNA expression libraries, including viral RNA, from a single sample of whole blood. Optimization of this protocol, improved RNA purity, increased ligation for recovery of methylated RNAs, and omitted&#160;size selection, to allow capture of more RNA species.

Here, we present a protocol optimized for the processing of coding (mRNA) and non-coding&#160;(ncRNA) globin reduced RNA-seq libraries from a single whole blood sample.

وأعرب عن تحديد الترميز وفئات الحمض النووي الريبي غير الترميز في الخنازير الدم كله

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Measurement of Specific Mycobacterial Mistranslation Rates with Gain-of-function Reporter Systems

The translation of genes into proteins is prone to errors. Although the average rate of translational error in model systems is estimated to be 1/10,000 per codon, the actual error rates vary widely, depending on the species, environment, and codons being studied. We have previously shown that mycobacteria use a two-step pathway for the generation of aminoacylated glutamine and asparagine tRNAs and that this is specifically associated with relatively high error rates due to the modulation of mistranslation rates by an essential component of the pathway, the amidotransferase GatCAB. We modified a previously employed Renilla-Firefly dual-luciferase system that had been used to measure mistranslation rates in Escherichia coli for use in mycobacteria to measure specific mistranslation rates of glutamate at glutamine codons and aspartate for asparagine codons. Although this reporter system was suitable for the accurate estimation of specific error rates, lack of sensitivity and requirements for excessive manipulation steps made it unsuitable for high-throughput applications. Therefore, we developed a second gain-of-function reporter system, using Nluc luciferase and green fluorescent protein (GFP), which is more amenable to medium/high-throughput settings. We used this system to identify kasugamycin as a small molecule that can decrease mycobacterial mistranslation. Although the reporters that we describe here have been used to measure specific types of mycobacterial mistranslation, they may be modified to measure other types of mistranslation in a number of model systems.

In this article, we present two complementary methods to measure specific rates of translational error and mistranslation in the model mycobacterium, Mycobacterium smegmatis, using gain-of-function reporter systems. The methods can be employed to measure accurate error rates in low throughput or relative error rates in a more high-throughput setting.

قياس معدلات المتفطرات المحددة مع أنظمه المراسلة التي تكتسب وظيفة

The translation of genes into proteins is prone to errors. Although the average rate of translational error in model systems is estimated to be 1/10,000 ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

في اختبار فيترو ELISA لتقييم قوة لقاح داء الكلب

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...