يوضح هذا الفيديو كيفية تقييم المناعة في الجسم الحي للحويصلات خارج الخلية المشتقة من الورم ، أو EVs ، باستخدام قياس التدفق الخلوي. طريقة الفحص الموصوفة هنا سهلة الأداء نسبيا ويمكن تكييفها مع الإعدادات المختلفة. في السرطان ، تحديد ظروف إطلاق الحويصلة خارج الخلية المناعية ذات الصلة الانتقالية الخاصة.
على هذا النحو ، يمكن استخدام EVs الذاتية كعلاجات شخصية مضادة للسرطان. ستوضح الجزء الأول من الإجراء تاتيانا نيدلكو ، وهي مساعدة فنية من مختبري. لبدء إعداد وسائط زراعة الخلايا اللازمة للحويصلة خارج الخلية ، أو EVs ، استنفد المركبات الكهربائية البقرية في وسائط FCS عن طريق الطرد المركزي الفائق عند 100،000 مرة غرام لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية.
تخلص من الكريات بعد الطرد المركزي. حصاد خلايا الورم الميلانيني B16 الفئران التي تعبر عن ovalbumin ، أو خلايا B16-OVA ، من الثقافة وغسل الخلايا مرتين مع PBS. ثم ، زرع الخلايا بتركيز 400،000 خلية لكل ملليلتر في الوسائط المستنفدة EV.
بعد ذلك ، عالج خلايا B16-OVA ب 30 ميكروغرام من أوكساليبلاتين لكل ملليلتر واحتضنها لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية مع عينات تحكم غير معالجة. بعد 24 ساعة ، اجمع السوبرنات لجهاز الطرد المركزي بسرعة 400 مرة لمدة خمس دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من الكريات قبل الطرد المركزي مرة أخرى عند 2000 مرة غرام لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
بعد التخلص من الكريات ، قم بتصفية supernatant من خلال مرشح غشاء PVDF 220 نانومتر في أنبوب جديد. ثم ، امزج 1 ملليلتر من supernatant مع 0.5 ملليلتر من كاشف عزل exosome محدد متاح تجاريا. دوامة ونقل الخليط إلى أنابيب 1.5 ملليلتر ، تليها حضانة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
في اليوم التالي ، قم بالطرد المركزي للخليط عند 10،000 مرة غرام لمدة 60 دقيقة عند 4 درجات مئوية. بعد التخلص بعناية من السوبرناتانت ، قم بإزالة القطرات المتبقية عن طريق النقر على أنبوب 1.5 ملليلتر رأسا على عقب على منشفة ورقية وعن طريق الشفط من خلال طرف ناعم من ماصة دون لمس حبيبة EV في الأسفل. أعد تعليق الكريات في PBS البارد عن طريق السحب لأعلى ولأسفل دون خدش الكريات بالطرف.
ثم ، قم بتجميع EVs من جميع الأنابيب. إذا لم يتم استخدامها على الفور ، فقم بتخزين معلقات EV عند 80 درجة مئوية في أوعية مصنوعة من السيليكون لمدة تصل إلى 28 يوما حتى التطبيق. لتحصين كل فأر في مجموعة العلاج بمركبات كهربائية معزولة من 4.0 × 10 إلى خلايا B16-OVA الخامسة ، امزج 5 ميكرولترات من تعليق EV مع 55 ميكرولتر من PBS البارد.
بعد ذلك ، املأ المحاقن المثبتة بإبر قياس 26 إلى 30 مع 60 ميكرولتر من EVs المخففة أو PBS ثم ضع المحقنة على الفور على الجليد. قم بتلقيح EVs أو PBS تحت الجلد في الجانب الإنسي من فخذ الفئران. كرر التحصين بعد سبعة أيام.
بعد 14 يوما من العلاج الأول ، ضحى بالفئران لاستئصال الطحال. ثم ، اهرسي الطحال المقطوع باستخدام مصفاة خلية مبللة بسعة 100 ميكرومتر ومكبس بلاستيكي لمحقنة. اغسل الخلايا الطحالية في أنبوب 50 ملليلتر مع 5 إلى 10 ملليلتر من RPMI الكامل البارد.
بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا بسرعة 400 مرة غرام لمدة خمس دقائق عند 4 درجات مئوية قبل التخلص من المادة الفائقة. لإزالة كريات الدم الحمراء من تعليق الخلية ، أعد تعليق واحتضان حبيبة الخلية مع 2 ملليلتر من مخزن تحلل خلايا الدم الحمراء لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم ، أوقف التفاعل بإضافة خمسة إلى 10 ملليلتر من RPMI الكامل ، متبوعا بالطرد المركزي كما هو موضح سابقا.
بعد إعادة تعليق حبيبات الخلايا في RPMI كاملة ، قم بحساب الخلايا من كل فأر ووضع ثلاثة أضعاف 200،000 خلية طحالية مع 200 ميكرولتر من cRPMI في كل بئر من صفيحة 96 بئرا مع قاع على شكل حرف U. ثم ، احتضن الألواح لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية. بعد 48 ساعة ، عالج مزرعة الخلايا ب 5 نانوغرام لكل ملليلتر بريفيلدين A ، و 20 نانوغرام لكل ملليلتر PMA ، و 1 ميكروغرام لكل ملليلتر Ionomycin عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.
بعد الحضانة ، انقل الخلايا الطحالية إلى صفيحة من 96 بئرا ذات قاع على شكل حرف V واغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS. أعد تعليق الخلايا الطحالية الحبيبية في محلول التلطيخ المعد حديثا واحتضن تعليق الخلية لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية محمية من الضوء. للتثبيت والنفاذية ، اغسل الخلايا الطحالية مرتين في المخزن المؤقت FACS-ثم أعد تعليق الخلايا الطحالية في 100 ميكرولتر لكل بئر من محلول التثبيت والنفاذية ، تليها الحضانة في الظلام كما هو موضح سابقا.
لتلطيخ غاما الإنترفيرون داخل الخلايا ، اغسل الخلايا الطحالية في المخزن المؤقت للتثبيت أو التخلل قبل إعادة إرسال الخلايا بالأجسام المضادة الفلورية ضد جاما الإنترفيرون المخففة 1:200 في المخزن المؤقت. احتضان الخلايا الطحالية لمدة 1 إلى 12 ساعة عند 4 درجات مئوية في الظلام. بعد الغسيل الشامل وإعادة التعليق في المخزن المؤقت FACS-، قم بتحليل تنشيط الخلايا التائية السامة للخلايا وفقا لاستراتيجية البوابات الموضحة في المخطوطة.
في الصورة التمثيلية ، يتم عرض استراتيجية البوابة لتحليل تنشيط الخلايا التائية السامة للخلايا. كانت الخلايا مسورة كخلايا مفردة ، ومجموعة فرعية من الخلايا الليمفاوية ، والخلايا التائية الإيجابية CD3 القابلة للحياة ، والخلايا التائية السامة للخلايا CD8 السلبية CD8. تم تقييم التراكم داخل الخلايا لجاما الإنترفيرون كعلامة بديلة للتنشيط.
بعد التحصين بالمركبات الكهربائية المشتقة من الخلايا السرطانية ، تمت دراسة تحريض استجابات الخلايا التائية الخاصة بالمستضدات في الفئران المتلقية. وقد أدت المركبات الكهربائية المشتقة من الورم المستزرعة في ظل ظروف الإجهاد السام الوراثي، مثل علاج أوكساليبلاتين، إلى تنشيط قوي للخلايا التائية السامة للخلايا الطحالية على النقيض من المركبات الكهربائية غير المعالجة. أظهرت مجموعة الحيوانات المعالجة بالمركبات أدنى استجابة.
تم تحديد تنشيط الخلايا التائية الطحالية بعد إعادة التحفيز خارج الجسم الحي إما في وجود أو عدم وجود ovalbumin. تم زيادة إنتاج جاما الإنترفيرون عندما تم إعادة تنشيط الخلايا الطحالية للحيوانات المعالجة بالورم EV مع نموذج مستضد الورم ovalbumin قبل التحليل. يرجى ملاحظة أن النتائج القابلة للتكرار تعتمد على فعالية العزل المستمرة للمركبات الكهربائية.
وبالتالي ، تأكد من إعادة تعليق كريات EV بالكامل وعلى الفور لتجنب الجفاف. باستخدام هذا البروتوكول ، تمكنا من تحليل مسارات محددة داخل الخلايا السرطانية التي تحدد مناعة المركبات الكهربائية المشتقة من الخلايا السرطانية. هذا قد يمهد الطريق لتسخير مثل هذه المركبات الكهربائية المناعية في علاج السرطان.
