يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على السؤال الرئيسي في مجال العلاج المناعي حول تقييم السمية الخلوية للخلايا المناعية ضد خلايا ورم الهيكل ثلاثي الأبعاد. المزايا الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها واضحة وأنها تجمع بين تكنولوجيا التصوير المتقدمة ومحسّناً مناعياً حساساً. تبدأ بغسل خط الخلايا السرطانية القولون والمستقيم من الفائدة مع خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني وإزالة الخلايا من قاع القارورة مع 0.5 ملليلتر من التربسين لمدة خمس دقائق في 37 درجة مئوية.
بعد تأكيد مفرزة تحت المجهر، تحييد إنزيم تفكك الخلية مع 10 ملليلتر من المتوسط الكامل وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. resuspend بيليه في خمسة ملليلتر من المتوسطة كاملة جديدة لحساب وإعادة تعليق الخلايا في 1.5 مرات 10 إلى الخلايا الثالثة في تركيز المليلتر. ثم بذور 200 ميكروليتر من الخلايا في كل بئر من 96 جيدا لوحة أسفل جولة ووضع لوحة في جهاز التصوير الآلي داخل حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون والرطوبة 95٪.
تسجيل الدخول إلى برنامج اقتناء الجهاز وحدد جدولة للحصول على، إطلاق إضافة سفينة، المسح الضوئي على الجدول الزمني، وإنشاء سفينة جديدة. بعد ذلك، حدد نوع المسح الضوئي Spheroid وحدد قنوات المجال الساطع وفلوريسنس المناسبة ذات الأهمية. تعيين التكبير إلى 10 مرات وحدد نموذج لوحة وموقعها داخل درج جهاز التصوير.
حدد موضع الآبار التي سيتم تصويرها وأدخل وصف التجربة بما في ذلك اسم ونوع الخلايا وعدد الخلايا. لإعداد التحليل، حدد تأجيل التحليل إلى وقت لاحق، انقر بزر الماوس الأيمن فوق المخطط الزمني، وحدد تعيين تحديد مجموعة المسح الضوئي تعيين الفواصل الزمنية، وتعيين إضافة المسح الضوئي كل إلى أربع ساعات و للإجمالي من 24 ساعة. ثم تعيين وقت البدء إلى ساعة واحدة على الأقل بعد الحضانة في جهاز التصوير الآلي.
للتحقق من تقدم النمو في spheroid، كل يومين، قم بتسجيل الدخول إلى برنامج التصوير وحدد عرض عمليات الفحص الحديثة. انقر نقراً مزدوجاً على تجربة الفائدة وحدد Brightfield في لوحة قنوات الصورة. ثم استخدم أداة قياس ميزات الصورة لقياس قطر الـ spheroids ، مع إضافة 50 ميكرولترات من المتوسط الكامل في البئر في اليوم الرابع للحد من أي تأثيرات تبخر متوسطة.
عندما تصل إلى حجم spheroids التجريبية المناسبة، بعناية زاوية لوحة واستخدام ماصة متعددة القنوات لإزالة بلطف 150 ميكرولترات من المتوسط الكامل من كل بئر دون إزعاج spheroids. بعد ذلك، استبدل الوسيط المهمل بـ 50 ميكرولترات من محلول واحد إلى 200 من Annexin V Red ووضع اللوحة في حاضنة لثقافة الخلية لمدة 15 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي التي يتم تحويلها CAR CD19 T الخلايا في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر وإعادة تعليق بيليه في مليلترين من المتوسط الكامل.
بعد العد، وتمييع الخلايا إلى مرتين 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر من تركيز متوسط كامل. ثم إضافة 100 ميكروليتر من خلايا CAR CD19 T إلى كل spheroid-تحتوي على جيدا والعودة لوحة إلى جهاز التصوير الآلي. في برنامج الاستحواذ، حدد جدول للحصول على وانقر بزر الماوس الأيمن على الجدول الزمني للمسح الضوئي.
حدد تحرير الجدول الزمني وانقر بزر الماوس الأيمن على مجموعة المسح الضوئي لحذفه. انقر بزر الماوس الأيمن فوق الجدول الزمني مرة أخرى وحدد تعيين تحديد مجموعة المسح الضوئي المحدد تعيين إضافة Scans كل إلى 1 1/2 ساعة و لإجمالي إلى 24 ساعة. ثم قم بتعيين وقت بدء التصوير إلى ساعة واحدة على الأقل بعد بدء الحضانة في جهاز التصوير الآلي وحدد Save Schedule Scans.
لتحليل الصور التلقائي، في برنامج المسح الضوئي، حدد عرض عمليات الفحص الحديثة وتحليل التشغيل. حدد إنشاء تعريف تحليل جديد ونوع التحليل Spheroid وتعيين قنوات الصورة ليتم تحليلها. حدد 10 صور تمثيلية على الأقل ومعاينة إجراء التحليل الافتراضي على رزمة الصور بأكملها.
تعديل معلمات قناع الحقل الساطع ومعاينة مكدس الصور، مع التأكد من أن المعلمات المحددة تكشف عن spheroids بدقة. تعديل معلمات قناع أخضر ومعاينة مكدس الصور للتأكد من أن المعلمات المحددة الكشف عن spheroids بدقة. تعديل معلمات قناع أحمر ومعاينة مكدس الصور للتأكد من أن المعلمات المحددة الكشف عن spheroids بدقة.
واحرص على تحقيق أفضل إشارة على الضوضاء والحساسية على نسب التحديد، مع الأخذ في الاعتبار أنك لن تكون قادرًا على العثور على مجموعة من المعلمات التي ستسمح بالتقاط كل حدث في كل وقت. ثم قم بتشغيل محلل. عند اكتمال التحليل، استخراج قياس الفائدة وحدد الملف المحلل ومقياس الرسم البياني الخيار.
حدد مقاييس الاهتمام والمسح الضوئي والآبار. انقر فوق تصدير البيانات لاستخراج المقاييس المحددة في تنسيقات ملفات متعددة. ثم، لاستخراج الصور، حدد الملف الذي تم تحليله وحدد تصدير الصور والأفلام.
يمكن تأكيد التعبير CD19 CAR على الخلايا التائية المُمَرَضة والتعبير CD19 على خلايا سرطان القولون والمستقيم المستحثة بواسطة قياس التدفق. هنا، يمكن ملاحظة نتيجة تجربة نموذجية من الزفيرويد. على عكس الخلايا التائية الوهمية، فإن خلايا CD19 CAR T قادرة على قتل الخلايا السرطانية القولونية المشتقة من الخلايا اللولبية المشتقة من الخلايا، مما يقلل إلى حد كبير من عدد الخلايا السرطانية الحية.
تتبع تطور مجموع الإشارات الخضراء والحمراء داخل الحدود الكروية مع مرور الوقت يكشف أنه بعد وقت قصير من حقن الخلايا T CAR CD19، حجم الزى يتقلص بسرعة كما يزيد إشارة المبرمج بسرعة. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل مقايسات السمية أو مقايسات ترحيل الخلايا أو قياسات بنية الروئيد للإجابة على أسئلة إضافية حول فحص المخدرات أو حركية الخلايا التائية أو تكوين الزفيرويد على التوالي.
