يوفر هذا البروتوكول تقنية صارمة وقابلة للتكرار لاستخراج وعزل العويصلات الصغيرة خارج الخلية من عينات الأنسجة الكاملة لتحليلات المصب السابقين في الجسم. مع بين أعلى مستويات النقاء التي يمكن تحقيقها حاليا، وهذا الأسلوب يسهل morphologic المباشر، المناعة، وتوصيف عميق من الحويصلات الخلالية يفرز في عينات الأنسجة المختلفة، بما في ذلك الأورام. هنا، نحن نبرهن على عزلة المركبات الكهربائية الأنسجة من الدماغ والرئة العينات الورم.
ومع ذلك، يمكن تطبيق هذه التقنية على الدراسات التي تستخدم عينات الورم المتنوعة أو الحميدة أو غيرها من العينات أيضاً. للبدء، إعداد 10 ملليلتر من العازلة تفكك في المتوسط إسبات-E لكل 0.4 إلى 1.0 غرام من الأنسجة. إضافة الأنسجة الطازجة أو المجمدة كلياً إلى المخزن المؤقت في أنبوب 50 ملليلتر، واحتضان في حمام ماء دافئ في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
بعد ذلك، إضافة مثبطات البروتياز والفوسفاتاز لتركيز 1x النهائي في العازلة تفكك. صب الحل مع الأنسجة في فضفاضة تناسب داونز التجانس. استخدم ما يقرب من 30 ضربة بطيئة لكل عينة لتفكك الأنسجة بلطف.
ثم, نقل الأنسجة المنفصلة والمحلول العازلة إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي في 500x ز و4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق ل بيليه الخلايا والألياف المتبقية أو شظايا الأنسجة متماسكة. نقل المكبر إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر نظيفة، والطرد المركزي في 2، 000x ز وعند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق ل بيليه والتخلص من الحطام الخلوي الكبير.
نقل هذا مكبر إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر نظيفة، والطرد المركزي في 10، 000x ز وعند أربع درجات مئوية لمدة 40 دقيقة ل بيليه أي هواسيكلات أكبر غير مرغوب فيها أو الهيئات المبرمجة الصغيرة. decant الماحتف من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر في أنبوب 12 ملليلتر نظيف للطرد الشديد. بعد ذلك، طارد العينة فائقة التركيز عند 100، 000x ز وعند أربع درجات مئوية لمدة ساعتين، إلى بيليه المركبات الكهربائية الصغيرة.
decant المغرور وترك أنابيب الطارد فائقة مقلوب لمدة خمس إلى 10 دقائق، والتنصت في كثير من الأحيان لإزالة أي السائل المتبقية على جانبي الأنابيب. ثم, resuspend بيليه EV في 1.5 ملليلتر من 0.25 مولار السكروز العازلة. تغطية الأنابيب مع بارا فيلم، ومن ثم دوامة المركبات الكهربائية في الحل.
صخرة أنابيب الطرد الفائقة لمدة 10 إلى 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم دوامة مرة أخرى. لفترة وجيزة الطرد المركزي الأنابيب بسرعة أقل من 1، 000x ز لاسترداد تعليق السائل في الجزء السفلي من الأنبوب.
إذا لزم الأمر، قم بتخزين التعليق عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. أولاً، أضف 1.5 ملليلتر من 60٪ iodixanol إلى 1.5 ملليلتر من المخزن المؤقت sucrose tris الذي يحتوي على المركبات الكهربائية لإنشاء حل نهائي يحتوي على 30٪ iodixanol. الماصات صعودا وهبوطا عدة مرات لخلط الحل بدقة.
نقل هذا الحل إلى الجزء السفلي من أنبوب 5.5 ملليلتر الطرد الفائق. بعد ذلك، اخلطي مخزون iodixanol 60٪ مع المياه النقية للغاية لإعداد 1.5 ملليلتر على الأقل من كل من 20٪ وحل iodixanol بنسبة 10٪. باستخدام حقنة وإبرة قياس 18، قياس 1.3 ملليلتر من محلول iodixanol 20٪، وطبقة بعناية على رأس التدرج السفلي.
الحفاظ على شطبة من الإبرة في اتصال مع داخل الأنبوب، فقط فوق الغضروف المفصلي وإضافة حل إسقاط الحكمة لتجنب خلط الطبقات في واجهة الكثافة. ثم، طبقة 1.2 ملليلتر من حل iodixanol 10٪على رأس طبقة 20٪، وذلك باستخدام نفس التقنية. توازن بعناية وتحميل أنابيب الطارد فائقة في دلاء الدوار.
تعيين التسارع وسرعة التباطؤ من الدوار دلو سوينغ إلى الحد الأدنى من معدلات، والطرد المركزي في 268، 000x ز وعند أربع درجات مئوية لمدة 50 دقيقة. في حين يجري الطرد العينة، التسمية 10 1.5 ملليلتر أنابيب microcentrifuge لكل عينة التي سوف تتوافق مع الكسور واحد إلى 10 من التدرج الكثافة. بمجرد اكتمال الطرد المركزي ، قم بإزالة الأنابيب بلطف من دلاء الدوار ووضعها في حامل مستقر.
Pipette 10 الكسور التسلسلية من 490 ميكرولترات من أعلى التدرج في الأنابيب المقابلة. باستخدام مقياس الانكسار، قم بقياس مؤشرات الانكسار للكسور. ثم، نقل كل كسر إلى أنبوب 12 ملليلتر نظيفة الطرد الفائق.
إضافة خمسة ملليلتر من 1X برنامج تلفزيوني لكل أنبوب وماصة صعودا وهبوطا ببطء لخلط. إضافة 6 ملليلتر إضافية من 1X برنامج تلفزيوني إلى أعلى الأنبوب، ومزيج بعناية مرة أخرى. فائقة التركيز على الأنابيب في 100، 000x ز وعند أربع درجات مئوية لإعادة بيليه في vesicles الصغيرة.
Decant فائقة والاستفادة من الأنابيب الجافة قبل التحلل من vesicles لتحليل البروتين أو reresuspending المركبات الكهربائية لتحليل morphologic. لlyse EVs لتحليل البروتين، إضافة 40 ميكرولترات من عازلة تحلل قوية تحتوي على مثبطات البروتياز إلى الكريات EV. مكان بارا فيلم فوق كل أنبوب، ودوامة بقوة.
بعد ذلك، صخرة الأنابيب لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ودوامة مرة أخرى. لفترة وجيزة الطرد المركزي العينة في 1، 000x ز لمدة 30 إلى 60 ثانية لاسترداد حجم العينة بأكملها. نقل كل عينة إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر microcentuge، وتخزينها في درجة حرارة تتراوح بين 20 و 80 درجة مئوية حتى جاهزة لمزيد من المعالجة.
لتحضير الليساتات المنقية لتحليل مناعي، إضافة 5x Laemmli عينة العازلة إلى العينات لتركيز النهائي من 1x. تغلي العينة في 95 درجة مئوية لمدة خمس إلى 10 دقائق. ثم، تحميل وحدة تخزين متساوية من الكسور واحد إلى 10 في هلام صفحة 10٪ SDS.
تحميل كتلة متساوية من تجانس الأنسجة. إجراء تحليل الكهربائي ولطخة الغربية لتأكيد البروتينات EV في lysates تنقية ومقارنة وفرة EV النسبية في الكسور. في هذه الدراسة، يتم استخراج الخلايا خارج الخلية وتنقيتها من الأنسجة بأكملها.
بعد الطرد من 10 إلى 30٪ iodixanol التدرج، ويمكن رؤية مجموعة من المركبات الكهربائية الخفيفة المهاجرة تصل إلى كسر اثنين، في حين يمكن رؤية مجموعة من المركبات الكهربائية الكثيفة الهجرة تصل إلى الكسر خمسة، اعتمادا على نوع الأنسجة. تظهر مناعة تمثيلية لكسور التدرج الفصل الفعال وتنقية المركبات الكهربائية الصغيرة المستمدة من الورم في الكسر الخامس. وتجدر الإشارة إلى أن عينات ورم الرئة تبدو غنية في المركبات الكهربائية الكثيفة مقارنة بالمصابيح الكهربائية الخفيفة التي تم حصادها سابقًا من أنسجة الدماغ بأكملها.
ممثل نانو الجسيمات التحليل وتتبع المجهر الإلكترون من الأنسجة المشتقة من vesicles في الحيصلة السائدة التي تحتوي على جزء يدل على إثراء والحفاظ على vesicles كاملة. بما يتفق مع حجم وبنية المركبات الصغيرة. وتمثل المركبات الكهربائية الخلالية أهدافا واعدة لتطوير مقايسات تشخيصية أو مؤشرات بيولوجية جديدة.
هذه التقنية تزود الباحثين بأدوات لاستخراج وتنقية من السقطات للفائدة المصب. بعد استخراج كامل أو أنسجة متحللة EVs، يمكن إجراء توصيف واسع من vesicles بما في ذلك البروتيومية، الجينوم، وتحليلات الدهون. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام العينات في اتباع نهج أكثر استهدافاً.
يمكن أن توفر الفُيصلات المعزولة مباشرة عن عينات الأنسجة المزيد من التبصر في آليات المرض، بما في ذلك نشأة الورم، وقد توفر أدوات تشخيصية أو تشخيصية مهمة في المستقبل.
