يوضح هذا البروتوكول المنهجية المناسبة لتقطيع أنسجة القلب والدماغ وتلطيخها. كما يوفر مبادئ توجيهية لإنشاء إعدادات الإضاءة والكاميرا وتقنيات التصوير الفوتوغرافي للحصول على الصور. هذه الطرق مفيدة بشكل خاص لإجراء القياسات في تحليل الصورة المخططة في أنسجة القوارض ، ويمكن أن تكون ذات قيمة للتصوير الكلي العلمي العام.
للبدء ، افصل قنية القلب عن المحقنة المملوءة بمحلول Krebs-Henseleit وتوصيلها بحقنة مملوءة بمحلول Krebs-Henseleit الدافئ الذي يحتوي على 0.1٪ من أزرق الميثيلين. قم بدمج قلب الفئران بأربعة ملليلترات من محلول الميثيلين الأزرق بمعدل أربعة ملليلتر في الدقيقة. بعد فصل القنية عن المحقنة وإزالة القلب من القنية ، قم بإزالة أزرق الميثيلين الزائد عن طريق لف القلب بلطف على ورق المناديل.
بعد إزالة أزرق الميثيلين الزائد ، قم بفك الرباط حول الشريان التاجي عن طريق فتح ملقط مرقئ وإزالة الأنابيب البلاستيكية حول الخياطة الجراحية. بعد ذلك ، ضع قلب الفئران الملون في مصفوفة من الفولاذ المقاوم للصدأ للتقطيع. قطع البطينين إلى شرائح بسمك مليمترين ، بهدف الحصول على ست إلى سبع شرائح من قلب فأر بالغ واحد.
بعد القطع ، انقل الشرائح إلى أنبوب بلاستيكي سعة 15 ملليلتر. ثم ، أضف خمسة ملليلترات من كلوريد رباعي الأوزوليوم ثلاثي الفينيل 1٪ المذاب في PBS إلى الأنبوب مع شرائح القلب واحتضنه لمدة 10 دقائق في حمام مائي عند 37 درجة مئوية مع خلط لطيف بعد خمس دقائق. بعد الحضانة ، اغسل شرائح القلب مرتين إلى ثلاث مرات على الأقل باستخدام PBS واستعد لالتقاط الصور.
بعد إزالة الدماغ ، بما في ذلك جذع الدماغ ، من الجمجمة ، ضع الدماغ مع جانبه البطني في مصفوفة الدماغ. اعتمادا على وزن الحيوانات ، اختر الحجم الصحيح لمصفوفة الفولاذ المقاوم للصدأ في الدماغ. باستخدام الشفرات ، قم بتقييد الأجزاء الأمامية والذيلية من الدماغ.
ثم ضع الشفرات جزئيا في القنوات بين الشفرات الأولى والأخيرة. عندما يتم إدخال جميع الشفرات وترتيبها بالتوازي ، اضغط على جميع الشفرات لأسفل براحة اليد في نفس الوقت لقطع الدماغ إلى شرائح إكليلية بمليمترين. ثم ، أمسك الشفرات بإحكام على طول الجانبين بإصبعين وقم بإزالتها مع الدماغ المقطع من المصفوفة.
رتب شرائح الدماغ واحدة تلو الأخرى في صينية ، مما يضمن أن السطح الداخلي لكل شريحة متجه دائما لأعلى. بعد ذلك ، صب محلول كلوريد رباعي الفينيل ثلاثي الفينيل الدافئ بنسبة 1٪ و PBS على شرائح الدماغ واحتضنه لمدة ثماني دقائق عند 37 درجة مئوية في الظلام. بعد الحضانة ، انقل شرائح الدماغ إلى صينية بلاستيكية زرقاء لالتقاط الصور.
رتب شرائح الدماغ بترتيب متسلسل من الجزء الأمامي إلى الجزء الذيلي واستخدم مشرطا لفصل نصفي الكرة الأرضية في المستوى السهمي. قم بتصوير شرائح الأنسجة مباشرة بعد التلطيخ. قم بإعداد الكاميرا التي تختارها باستخدام بطارية مشحونة وبطاقة ذاكرة وعدسة متصلة على حامل.
استنادا إلى مصادر الإضاءة المتاحة، حدد إعدادات توازن اللون الأبيض المناسبة أو قم بإجراء معايرة درجة حرارة اللون وفقا للإرشادات الواردة في دليل الكاميرا. اغمر شرائح القلب بالكامل في وعاء مع PBS. رتب شرائح الدماغ في صينية جافة بدون PBS أو سوائل أخرى.
ضع الحاوية مع شرائح أسفل الكاميرا باستخدام عدسة الماكرو. تأكد من أن جميع الشرائح مناسبة تماما في مجال الرؤية وأنها على نفس المستوى. قم بتبديل الكاميرا إلى الوضع اليدوي بالكامل ، واضبط ISO 100 ، وفتحة العدسة على F10.
اضبط سرعة الغالق للحصول على أفضل تعريض للصورة وتأكد من أن المستوى البؤري للكاميرا مواز للسطح حيث توجد العينة. بعد التقاط رقم العينة، قم بتدوير مرشح الاستقطاب الدائري حتى تختفي الانعكاسات، وصور شريحة الأنسجة باستخدام مشغل عن بعد لمنع اهتزاز الكاميرا عند تحرير الغالق، ثم قم بتدوير الشرائح والتقاط الصور من الجانب الآخر. تحتوي هذه الصورة لشريحة قلب ملطخة بكلوريد الميثيلين الأزرق وثلاثي فينيل تترازوليوم بعد احتشاء عضلة القلب على تفاصيل ومعلومات ملونة كافية لمزيد من التحليل الخطي لحجم الاحتشاء.
يؤثر تجميد أنسجة القلب لمدة 24 ساعة على السلامة ويقلل من وظيفة الميتوكوندريا. وبالتالي ، فإن تلطيخ كلوريد رباعي الفينيل ثلاثي الفينيل في القلب ليس أحمر ولكن وردي شاحب ، والحدود بين الأنسجة الميتة والقابلة للحياة غير واضحة. من بين الطريقتين المقارنتين لتقليل الانعكاسات في العينات ، يعد الغمر الطريقة الأكثر كفاءة وينتج صورا مفصلة ذات تباين جيد.
مرشح الاستقطاب فعال أيضا ، ومع ذلك ، فإنه يقلل قليلا من الدقة والتباين الدقيق للصورة. تحتوي صورة شريحة القلب بدون غمر أو مرشح على العديد من الانعكاسات وهي غير مناسبة لمزيد من التحليل. في التحليل الخطوي ، يجب مقارنة الجانب غير المتأثر من الدماغ بالجانب المصاب بالسكتة الدماغية.
تضمن إعدادات الكاميرا اليدوية التعريض الضوئي الأمثل وتوازن اللون الأبيض لجميع الصور، مما يسمح بإجراء تحليل موحد. يتم عرض أمثلة على الصور المكشوفة وغير المكشوفة لشرائح القلب هنا. علاوة على ذلك، تؤدي إعدادات توازن اللون الأبيض غير الصحيحة إلى التحول إلى اللون الأزرق أو الأصفر والأرجواني أو الأخضر في الصورة.
يتطلب التصوير الكلي العلمي إضاءة يتم التحكم فيها وإعداد تصوير مناسب. تضمن المنهجية الموحدة صورا رقمية عالية الجودة ومفصلة. تنطبق هذه الطريقة على جميع صور أعضاء الحيوانات الصغيرة التجريبية.
