Este protocolo muestra la metodología adecuada para el corte y tinción del tejido cardíaco y cerebral. También proporciona pautas para establecer configuraciones de iluminación y cámara y técnicas de fotografía para la adquisición de imágenes. Estos métodos son particularmente útiles para realizar mediciones en el análisis planimétrico de imágenes en tejidos de roedores, y pueden ser de valor para la macrofotografía científica general.
Para comenzar, separe la cánula del corazón de la jeringa llena de solución de Krebs-Henseleit y conéctela a una jeringa llena de solución tibia de Krebs-Henseleit que contenga azul de metileno al 0,1%. Perfunda el corazón de rata con cuatro mililitros de la solución de azul de metileno a una velocidad de cuatro mililitros por minuto. Después de desconectar la cánula de la jeringa y extraer el corazón de la cánula, retire el exceso de azul de metileno enrollando suavemente el corazón sobre papel de seda.
Después de eliminar el exceso de azul de metileno, afloje la ligadura alrededor de la arteria coronaria abriendo las pinzas hemostáticas y retirando el tubo de plástico alrededor de la sutura quirúrgica. A continuación, coloque el corazón de rata manchado en una matriz de acero inoxidable para cortar. Corte los ventrículos en rodajas de dos milímetros de grosor, apuntando a seis a siete rebanadas de un corazón de rata adulto.
Después de cortar, transfiera las rodajas a un tubo de plástico de 15 mililitros. Luego, agregue cinco mililitros de cloruro de tetrazolio trifenilo al 1% disuelto en PBS al tubo con las rodajas de corazón e incube durante 10 minutos en un baño de agua a 37 grados Celsius con una mezcla suave después de cinco minutos. Después de la incubación, lave las rodajas del corazón al menos dos o tres veces con PBS y prepárese para la captura de imágenes.
Después de extraer el cerebro, incluido el tronco encefálico, del cráneo, coloque el cerebro con su lado ventral hacia arriba en la matriz cerebral. Dependiendo del peso de los animales, elija el tamaño correcto de la matriz de acero inoxidable cerebral. Usando cuchillas, restrinja las partes frontal y caudal del cerebro.
Luego, coloque las cuchillas parcialmente en los canales entre la primera y la última cuchilla. Cuando todas las cuchillas estén insertadas y dispuestas en paralelo, presione todas las cuchillas hacia abajo con la palma de la mano al mismo tiempo para cortar el cerebro en rodajas coronales de dos milímetros. Luego, agarre las cuchillas firmemente a lo largo de los lados con dos dedos y retírelas junto con el cerebro cortado de la matriz.
Coloque las rebanadas cerebrales una por una en una bandeja, asegurándose de que la superficie interior de cada rebanada esté siempre hacia arriba. A continuación, vierta una solución tibia de cloruro de tetrazolio trifenilo al 1% y PBS en las rodajas cerebrales e incube durante ocho minutos a 37 grados centígrados en la oscuridad. Después de la incubación, transfiera las rodajas cerebrales a una bandeja de plástico azul para capturar imágenes.
Organice las rodajas cerebrales en orden secuencial desde la parte frontal hasta la parte caudal y use un bisturí para separar los hemisferios en el plano sagital. Fotografíe las rodajas de tejido inmediatamente después de la tinción. Configure la cámara de su elección con una batería cargada, una tarjeta de memoria y una lente conectada en un soporte.
Dependiendo de las fuentes de luz disponibles, seleccione la configuración de balance de blancos adecuada o realice la calibración de la temperatura de color de acuerdo con las instrucciones del manual de la cámara. Sumerja las rodajas de corazón completamente en un recipiente con PBS. Coloque las rebanadas de cerebro en una bandeja seca sin PBS u otros líquidos.
Coloque el recipiente con rodajas debajo de la cámara con la lente macro. Asegúrese de que todos los cortes encajen completamente en el campo de visión y estén en el mismo plano. Cambie la cámara al modo totalmente manual, ajuste el ISO 100 y la apertura a F10.
Ajuste la velocidad de obturación para una exposición óptima de la imagen y asegúrese de que el plano focal de la cámara esté paralelo a la superficie donde se coloca la muestra. Después de capturar el número de muestra, gire el filtro polarizador circular hasta que desaparezcan los reflejos, e imagine la rebanada de tejido con un disparador remoto para evitar que la cámara se sacuda cuando se suelta el obturador, luego gire las rodajas y capture imágenes desde el otro lado. Esta fotografía de una rebanada de corazón teñida de cloruro de azul de metileno y tetrazolio de trifenilo después de un infarto de miocardio contiene suficiente detalle e información de color para un análisis planimétrico adicional del tamaño del infarto.
La congelación del tejido cardíaco durante 24 horas afecta la integridad y reduce la función mitocondrial. Por lo tanto, la tinción de cloruro de trifenilo tetrazolio del corazón no es roja sino de color rosa pálido, y el borde entre los tejidos necróticos y viables es borroso. De los dos métodos comparados para reducir las reflexiones en los especímenes, la inmersión es el método más eficiente y produce imágenes detalladas con buen contraste.
El filtro polarizador también es efectivo, sin embargo, reduce ligeramente la resolución y el microcontraste de la imagen. Una imagen de una rebanada de corazón sin inmersión o filtro contiene muchas reflexiones y no es adecuada para un análisis posterior. En el análisis planimétrico, el lado no afectado del cerebro debe compararse con el lado afectado por el accidente cerebrovascular.
La configuración manual de la cámara garantiza una exposición y un balance de blancos óptimos de todas las imágenes, lo que permite un análisis uniforme. Aquí se muestran ejemplos de imágenes sobreexpuestas y subexpuestas de cortes de corazón. Además, la configuración incorrecta del balance de blancos da como resultado un cambio a azul o amarillo y magenta o verde fundido en la imagen.
La macrofotografía científica requiere una iluminación controlada y una configuración de imagen adecuada. La metodología estandarizada garantiza imágenes digitales detalladas y de alta calidad. Este método es aplicable a todas las fotografías experimentales de órganos de animales pequeños.
