هنا، ونحن نصف طريقة تعليمية على أساس تعطيل الحرارة السريعة من البروتيز للحفاظ على الببتيدات الطبيعية داخل الخلايا، وتجنب التدهور في الخلايا والأنسجة، تليها الكمية النسبية من الببتيدات باستخدام وضع العلامات النظيرية. هذه الطريقة وضع العلامات لديها الكثير من المزايا. الكواشف متوفرة تجاريا، وغير مكلفة، ومستقرة كيميائيا، ويسمح بتحليل ما يصل إلى خمس عينات في مصل واحد.
ابدأ بزراعة خلايا الورم الأرومي العصبي البشري في طبق طوله 15 سنتيمترا في DMEM يحتوي على 15٪ FBS و 1٪ من العقديات البنسلين. الحفاظ على الخلايا في 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون. غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني، ثم إضافة 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني، كشط الخلايا، وجمعها في أنبوب 15 ملليلتر.
طرد الخلايا في 800 مرة G لمدة خمس دقائق وإزالة supernatant. إعادة تشغيل بيليه في ملليلتر واحد من المياه فائقة تنقية deionized في 80 درجة مئوية، ثم نقل محتويات الأنبوب إلى أنبوب ميكروفوجيه ملليلتر اثنين. بعد تعطيل الحرارة من حمار وحشي، وجمع الدماغ كله في أنبوب ميكروفوجيلتر اثنين وتجميده في ناقص 80 درجة مئوية حتى التحليل.
إعادة ضغط عينة الأنسجة في ملليلتر واحد من المياه شديدة التأين النقية في 80 درجة مئوية وسونيكاتي مع مسبار باستخدام 30 نبضة من ثانية واحدة. احتضان الأنسجة الخلوية lysate أو متجانسة في 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة، ثم تبريده على الجليد لمدة 10 إلى 30 دقيقة. إضافة 10 ميكرولترات من محلول مخزون حمض الهيدروكلوريك المولاري لكل ملليلتر واحد من حجم العينة.
تخلط عن طريق الدوامة لمدة 20 ثانية واحتضان على الجليد لمدة 15 دقيقة. طرد المركزية lysate الخلوية أو الأنسجة المتجانسة في 12،000 مرة G في أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. جمع supernatant في أنابيب البروتين microcentrifuge منخفضة الربط وتخزينها في ناقص 80 درجة مئوية.
قم بتنظيف أجهزة الترشيح الفائق بالماء والطرد المركزي بمعدل 2 أو 300 مرة G لمدة ثلاث دقائق، ثم تخلص من الماء من جهاز الترشيح الفائق. ماصة العملاقة في مرشح قطع 10 كيلودالتون مغسولة مسبقا وتدور في جهاز طرد مركزي مبرد في أربع درجات مئوية. تحقق من رقم الحموضة للعينة.
توازن العمود مع ملليلتر واحد من 100٪ أسيتونيتريل، ثم يغسل مع ملليلتر واحد من 5٪ أسيتونيتريل مع حمض ثلاثي فلوري الأسيتيك 0.1٪. تحميل الحجم الكامل للعينة في العمود وغسل العمود مع ملليلتر واحد من 5٪ أسيتونيتريل مع حمض ثلاثي فلوري 0.1٪. Elute الببتيدات من العمود مع 1.8 ملليلتر من 1٪ أسيتونيتريل مع 0.15٪ حمض ثلاثي فلوريك في أنابيب البروتين منخفضة الربط الطرد المركزي الدقيق.
جفف العينة بالكامل في جهاز طرد مركزي فراغي عند 30 درجة مئوية وراقب وقت التركيز المعروض. تخزين العينة في ناقص 80 درجة مئوية. Resuspend عينات الببتيد في 100 إلى 200 ميكرولتر من المياه النقية للغاية وماصة 2.5 ميكرولتر من تركيزات الببتيد القياسية والعينات على لوحة بيضاء 96 جيدا.
إضافة 25 ميكرولتر من 0.2 ضرس الفوسفات العازلة و 12.5 ميكرولتر من الفلورسكمين. تجانس بلطف لمدة دقيقة واحدة على الدوار المداري. بعد ذلك ، أضف 110 ميكرولتر من الماء لوقف رد الفعل.
ضبط الإعدادات على مقياس الطيف، ثم قراءة لوحة. أضف 1/10th حجم واحد من بروميد المول trimethylammonium إلى كل عينة الببتيد مع ما يصل إلى 25 ميكروغرام من الببتيد. تأكد من أن درجة الحموضة بين خمسة وثمانية، والتكيف مع حمض الهيدروكلوريك أو هيدروكسيد الصوديوم، إذا لزم الأمر.
إضافة أربعة ميكرولترات من الفورمالديهايد غير deuterated، deuterated أو الكربون-13 الفورمالديهايد deuterated. تخلط لمدة خمس ثوان عن طريق الدوامة. أضف أربعة ميكرولترات من سيانوبوروهيدريد الصوديوم أو سيانوبوروهيدريد الصوديوم المقيت إلى عينة الببتيد.
ثم خلط العينة لمدة خمس ثوان عن طريق الدوامة. احتضان عينة الببتيد في غطاء الدخان لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة ، دوامة كل 30 دقيقة. كرر إضافة غير deuterated، deuterated، أو الكربون-13 الفورمالديهايد deuterated والصوديوم سيانوبوروهيدريد أو الصوديوم deuterated سيانوبوروهيدريد، دوامة بعد كل إضافة.
احتضان العينات في غطاء الدخان بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. إضافة 16 ميكرولتر من بيكربونات الأمونيوم وتخلط عن طريق الدوامة. ضع العينة على الثلج.
إضافة ثمانية ميكرولتر من حمض الفورميك 5٪ ودوامة لمدة خمس ثوان أخرى. الجمع بين عينات الببتيد، وضبط درجة الحموضة بين اثنين وأربعة، ثم تحلية العينات مجتمعة على أعمدة تنظيف المرحلة عكس باستخدام أسيتونيتريل وحمض ثلاثي فلوريك كما هو موضح سابقا. جفف العينة بالكامل في جهاز طرد مركزي فراغي عند 30 درجة مئوية، ثم قم بتخزينها عند ناقص 20 درجة مئوية.
تتم ملاحظة الببتيدات المسماة باستخدام أطياف الكتلة. تشير الأسهم الحمراء إلى وجود أزواج الذروة من الببتيدات المختلفة المسماة بنماذج نظائريين اثنين ، L1 و L5 ، للمقارنة بين عينتين مختلفتين S1 و S2 على التوالي. يظهر هنا الطيف الكتلي للببتيد الموجود في ثلاث عينات مختلفة، وهي S1 وS2 وS3، المسمى بعلامات L1 وL3 وL5 على التوالي.
تم إجراء وضع علامات رباعية. وسمت عينات التحكم S1 وS3 ب L1 وL3 على التوالي، وقورنت بعينتين تجريبيتين، هما S2 و S4 المسمىتان بال L2 ولوحظ L4.No فرق كبير. تم استخدام وضع العلامات النظيرية لإظهار الركائز في المنتجات في المختبر لبروتيز معين أو بيبتيديز.
يظهر الببتيد الذي لا يتغير في وجود إنزيم الذهان هنا. الببتيدات التي تختفي أو تقلل في وجود الإنزيم هي ركائز ، في حين أن تلك التي تزيد تعتبر منتجات. هذا الرقم هو مثال على تحديد تسلسل الببتيد الذي يقوم به محرك بحث قاعدة بيانات المسمى مع ثلاثة أشكال مختلفة من العلامات.
قبل أن يتم تعريفها، تأكد من أن العينة باردة تماما لتجنب كسر روابط الببتيد الناجمة عن التحمض الصلب. بالإضافة إلى ذلك ، فإن تنظيف أجهزة الترشيح الفائق أمر ضروري. قياس الطيف الكتلي هو طريقة ممتازة لقياس الببتيدات بين الظروف التجريبية المختلفة ودراسات التحليل من خلال تحديد ركائز الببتيداز.
