Qui, descriviamo un metodo didattico basato su una rapida inattivazione termica della proteasi per preservare i peptidi intracellulari naturali, evitare la degradazione nelle cellule e nei tessuti, seguita dalla quantificazione relativa dei peptidi utilizzando l'etichettatura isotopica. Questo metodo di etichettatura ha così tanti vantaggi. I reagenti sono disponibili in commercio, poco costosi, chimicamente stabili e consentono l'analisi di un massimo di cinque campioni in un singolo siero.
Inizia coltivando cellule di neuroblastoma umano in un piatto di 15 centimetri in DMEM contenente il 15% di FBS e l'1% di penicillina streptomicina. Mantenere le cellule a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica. Lavare le cellule due volte con PBS, quindi aggiungere 10 millilitri di PBS, raschiare le cellule e raccoglierle in un tubo da 15 millilitri.
Centrifugare le cellule a 800 volte G per cinque minuti e rimuovere il surnatante. Risospesso il pellet in un millilitro di acqua deionizzata ultra purificata a 80 gradi Celsius, quindi trasferire il contenuto del tubo in un tubo di microfuga da due millilitri. Dopo l'inattivazione termica del pesce zebra, raccogliere l'intero cervello in un tubo di microfuga da due millilitri e congelarlo a meno 80 gradi Celsius fino all'analisi.
Risospesare il campione di tessuto in un millilitro di acqua deionizzata ultra purificata a 80 gradi Celsius e sonicare con una sonda utilizzando 30 impulsi di un secondo. Incubare il tessuto cellulare lisato o omogeneizzato a 80 gradi Celsius per 20 minuti, quindi raffreddarlo sul ghiaccio per 10-30 minuti. Aggiungere 10 microlitri di una soluzione madre di acido cloridrico molare per ogni millilitro di volume del campione.
Mescolare vorticosamente per 20 secondi e incubare sul ghiaccio per 15 minuti. Centrifugare il lisato cellulare o il tessuto omogeneizzato a 12.000 volte G in quattro gradi Celsius per 15 minuti. Raccogliere il surnatante in tubi microcentrifuga proteici a basso legame e conservarlo a meno 80 gradi Celsius.
Pulire i dispositivi di ultrafiltrazione con acqua e centrifugare a 2.300 volte G per tre minuti, quindi eliminare l'acqua dal dispositivo di ultrafiltrazione. Pipettare il surnatante in un filtro di taglio pre-lavato da 10 kilodalton e ruotare in una centrifuga refrigerata a quattro gradi Celsius. Controllare il pH del campione.
Equilibrare la colonna con un millilitro di acetonitrile al 100%, quindi lavarla con un millilitro di acetonitrile al 5% con acido trifluoroacetico allo 0,1%. Caricare il volume completo del campione nella colonna e lavare la colonna con un millilitro di acetonitrile al 5% con acido trifluoroacetico allo 0,1%. Eluire i peptidi dalla colonna con 1,8 millilitritri di acetonitrile all'1% con acido trifluoroacetico allo 0,15% in tubi microcentrifuga a basso legame proteico.
Asciugare completamente il campione in una centrifuga sottovuoto a 30 gradi Celsius e monitorare il tempo di concentrazione in esposizione. Conservare il campione a meno 80 gradi Celsius. Sospendere i campioni peptidici in 100-200 microlitri di acqua ultra purificata e pipettare 2,5 microlitri delle concentrazioni peptidiche standard e campioni sulla piastra bianca a 96 pozzetti.
Aggiungere 25 microlitri di 0,2 tampone fosfato molare e 12,5 microlitri di fluorescamina. Omogeneizzare delicatamente per un minuto sul rotatore orbitale. Quindi, aggiungere 110 microlitri di acqua per fermare la reazione.
Regolare le impostazioni sullo spettrofluorometro, quindi leggere la piastra. Aggiungere 1/10 di volume di un bromuro molare di trimetilammonio a ciascun campione di peptide con un massimo di 25 microgrammi di peptide. Assicurarsi che il pH sia compreso tra cinque e otto, regolando con acido cloridrico o idrossido di sodio, se necessario.
Aggiungere quattro microlitri di formaldeide deuterata, deuterata o formaldeide deuterata al carbonio-13. Mescolare per cinque secondi vorticosamente. Aggiungere quattro microlitri di cianoboroidruro di sodio o cianoboroidruro di sodio deuterato al campione di peptidi.
Quindi mescolare il campione per cinque secondi vorticosamente. Incubare il campione di peptide in una cappa aspirante per due ore a temperatura ambiente, vorticando ogni 30 minuti. Ripetere l'aggiunta di formaldeide deuterata non deuterata, deuterata o carbonio-13 e cianoboroidruro di sodio o cianoboroidruro di sodio deuterato, vorticosa dopo ogni aggiunta.
Incubare i campioni nella cappa aspirante durante la notte a temperatura ambiente. Aggiungere 16 microlitri di bicarbonato di ammonio e mescolare vorticosamente. Posizionare il campione sul ghiaccio.
Aggiungere otto microlitri di acido formico al 5% e vortice per altri cinque secondi. Combinare i campioni peptidici, regolare il pH tra due e quattro, quindi desallare i campioni combinati su colonne di pulizia in fase inversa utilizzando acetonitrile e acido trifluoroacetico come descritto in precedenza. Asciugare completamente il campione in una centrifuga sottovuoto a 30 gradi Celsius, quindi conservarlo a meno 20 gradi Celsius.
I peptidi marcati sono osservati usando spettri di massa. Le frecce rosse indicano la presenza di coppie di picco di diversi peptidi etichettati con due forme isotopiche, L1 e L5, per il confronto tra due diversi campioni S1 e S2 rispettivamente. Lo spettro di massa di un peptide presente in tre diversi campioni, S1, S2 e S3, etichettati rispettivamente con tag L1, L3 e L5 è mostrato qui.
È stata eseguita un'etichettatura quadruplex. I campioni di controllo S1 e S3 sono stati etichettati rispettivamente con L1 e L3 e confrontati con due campioni sperimentali, S2 e S4 etichettati con L2 e L4.No è stata osservata una differenza significativa. L'etichettatura isotopica è stata utilizzata per mostrare i substrati nei prodotti in vitro per una data proteasi o peptidasi.
Un peptide che non cambia in presenza dell'enzima neurolisina è mostrato qui. I peptidi che scompaiono o si riducono in presenza dell'enzima sono substrati, mentre quelli che aumentano sono considerati prodotti. La figura è un esempio di identificazione di una sequenza peptidica eseguita da un motore di ricerca di database etichettato con tre diverse forme di tag.
Prima di essere definito, assicurarsi che il campione sia completamente fresco per evitare di rompere i legami peptidici causati dall'acidificazione dura. Inoltre, la pulizia dei dispositivi di ultrafiltrazione è essenziale. la spettrometria di massa è un metodo eccellente per quantificare i peptidi tra diverse condizioni sperimentali e per studi di analisi identificando substrati di peptidasi.
