يوضح هذا البروتوكول تبلور البروتين على جهاز يشبه الرقاقة في تذكر بيانات حيود الأشعة السينية. يسمى هذا الجهاز بلورة على بلورة لأن بلورات البروتين تنمو على بلورة كوارتز واحدة. عند النمو الناجح لبلورات البروتين على هذه الأجهزة ، يتم جمع الآلاف من صور الحيود من كل جهاز في درجة حرارة الغرفة دون لمس بلورات البروتين.
حيود الأشعة السينية في درجة حرارة الغرفة ضروري جدا لدراسة وظيفة البروتين التي تنطوي على العديد من الحالات المطابقة. يمكن تجميد هذه التغييرات البروتينية المفيدة أو إجراءات البروتين ، وبالتالي لا يمكن اكتشافها في علم البلورات بالتبريد. يمكن استخدام هذه الأجهزة لدراسة عمليات الإشارات التي يسببها الضوء وتغيرات الأكسدة والاختزال.
فقط عدد قليل من الأجهزة يعطي مجموعات بيانات كاملة وزائدة عن الحاجة. لبدء التجميع المسبق للجهاز ، قم بتسمية الحلقة الخارجية لتحديد العينة. قم بتضمين اسم المشروع ورقم الجهاز وحالة التبلور والتاريخ حسب الرغبة.
ثم ضع الحلقة الموسومة رأسا على عقب على سطح نظيف وضع رقاقة كوارتز واحدة داخل الحلقة الخارجية. بعد ذلك ، صب كمية صغيرة من زيت الغمر المجهري في طبق بتري واغمس رقاقة في الزيت لضمان طلاء جانبي الرقاقة جيدا. قم بإزالة أي زيت زائد عن طريق وضع الرقاقة على سطح نظيف.
ثم ضع الرقاقة المزيتة فوق رقاقة الكوارتز الأولى. امزج محلول البروتين ومحلول التبلور على رقاقة الكوارتز الأولى باستخدام ماصة. حاول تجنب فقاعات الهواء عند الخلط.
يجب ألا يتجاوز الحجم الكلي لمحلول التبلور السعة القصوى لغرفة التبلور التي يحددها حجم الرقاقة وسمكها. ضع رقاقة الكوارتز الثانية فوق المحلول المختلط. سوف ينتشر الحل تلقائيا.
ثم اضغط على رقاقة الكوارتز الثانية برفق على الحافة للمساعدة في نشر الزيت أثناء دفع الهواء للخارج. قم بتأمين الجهاز عن طريق شد حلقة الاحتفاظ في الحلقة الخارجية. إذا لزم الأمر ، استخدم أداة تشديد.
تجنب الإفراط في الشد لأنه قد يتسبب في تشوه رقائق الكوارتز الرقيقة أو تشققها. قم بتخزين الأجهزة المجمعة في صندوق في درجة حرارة الغرفة أو داخل حاضنة يتم التحكم في درجة حرارتها. بعد بضع ساعات أو أيام ، ضع جهاز التبلور تحت المجهر وراقب نمو البلورة.
إذا لزم الأمر ، قم بتحسين ظروف التبلور كما هو موضح في المخطوطة. للمعايرة ، قم بتثبيت بلورة YAG رفيعة على حامل الشريحة ، ثم قم بتثبيت توقف الشعاع. بعد ذلك ، افتح برنامج Insitux وقم بتشغيل البرنامج المشار إليه لالتقاط صور مضان بالأشعة السينية للشعاع المباشر حيث يكون الجهاز اسما يختاره المستخدم لجهاز التبلور والجهاز.
المعلمة هي اسم الملف الذي يحتوي على معلمات التحكم الخاصة بالجهاز. ثم ابحث عن الموضع الدقيق لحزمة الأشعة السينية المباشرة عن طريق تشغيل برنامج تركيب ملف تعريف الحزمة حيث تكون صورة النسخ هي اسم ملف صورة مضان الأشعة السينية. للمسح البصري ، ضع جهاز تبلور في حامل الشريحة وقم بتثبيته باستخدام برغي إبهامي.
ثم قم بتركيب حامل الشريحة على مرحلة الترجمة لمقياس الحيود من خلال آلية حركية. اعتمادا على حساسية الضوء لعينة البروتين والغرض من التجربة ، قم بتثبيت مصدر ضوء أبيض أو الأشعة تحت الحمراء لأخذ الصور المجهرية من النافذة البصرية للجهاز. بمجرد أن يصبح الإعداد جاهزا ، قم بتشغيل برنامج المسح عن طريق إدخال الأمر المشار إليه للمسح أثناء الحركة عند خط الشعاع.
ثم قم بتشغيل برنامج التجانب على كمبيوتر مستخدم حيث x هي القيمة الأولية للعمود و y هي القيمة الأولية للإزاحة المارقة للصور المجهرية. يقوم البرنامج بتجميع جميع الصور المجهرية في مونتاج بدقة بكسل واحد إلى ثلاثة ميكرومتر. بعد خياطة الصور المجهرية ، أدخل الأمر المشار إليه لتشغيل برنامج البحث عن البلورات.
يقوم هذا البرنامج بالتعرف على الكريستال وتخطيط اللقطة وتتيح المعلمات الرئيسية في هذا البرنامج اختيار الكريستال المحدد وتخطيط الهدف. قم بإزالة مصدر الضوء ووضع توقف الشعاع. ثم قم بتشغيل برنامج جمع البيانات للحيود التسلسلي.
يقوم الأمر المقترح بتشغيل جمع البيانات من خلال زيارة اللقطات المخطط لها في تسلسل مبرمج مسبقا. يتم نقل كل بلورة مستهدفة إلى موضع الحزمة. في كل محطة ، يتم أخذ التعرض للأشعة السينية إما مع أو بدون إضاءة ليزر في تأخير زمني محدد.
في الدراسة ، تمت مقارنة ظروف التبلور بين انتشار البخار ودفعة على الرقاقة. يتم عرض أربع دراسات حالة للتبلور على الرقاقة ومجموعات البيانات التمثيلية التي تم جمعها مباشرة من أجهزة الكوارتز هنا. كشفت تجارب علم البلورات الديناميكي عن تغيرات مستحثة بالضوء في بروتين مستقبلات الضوء الأحمر البعيد من خلال مقارنة البيانات من 4،352 بلورة في الظلام و 8،287 بلورة بعد إضاءة الضوء.
أدت مجموعة البيانات المظلمة من حيود Laue التسلسلي في الموقع إلى كثافات إلكترون تم حلها بشكل أفضل ، مما مكن من بناء نموذج واثق لكروموفور bilin في شكل علامة Z بالكامل. كشفت خرائط الفرق المستحثة بالضوء عن حركات منسقة في ورقة بيتا المركزية مما يشير إلى أهمية تكديس pi-pi بين حلقات pyrrole للكروموفور والعديد من المخلفات العطرية. هذه المنصة تسمى Insitux.
الميزة الفريدة لهذه المنصة هي أنه لا يتعين على المرء القيام بأي تلاعب بلوري بمجرد الانتهاء من التبلور. من الضروري جمع العديد من مجموعات البيانات في ظل ظروف متغيرة لالتقاط حركات البروتين. ويصبح هذا ممكنا مع Insitux لأنه يتيح جمع البيانات على نطاق واسع من آلاف بلورات البروتين في درجة حرارة الغرفة.
مع هذه القدرة الجديدة بما في ذلك علم البلورات ، يمكن تشغيل الأنظمة الحساسة للضوء داخل الجهاز ويمكن دراسة نظام الضوء الخامل إذا تم تحويل جهاز الكريستال على الكريستال إلى تدفقات خارجية.
