이 프로토콜은 X선 회절 데이터 회상에서 칩형 장치에서 단백질 결정화를 입증합니다. 이 장치는 단백질 결정이 단일 석영 결정에서 성장하기 때문에 결정 대 결정이라고 합니다. 이러한 장치에서 단백질 결정이 성공적으로 성장하면 단백질 결정을 건드리지 않고도 실온에서 각 장치에서 수천 개의 회절 이미지가 수집됩니다.
실온에서의 X선 회절은 많은 구조적 상태를 포함하는 단백질 기능을 연구하는 데 매우 중요합니다. 이 유익한 단백질 변화 또는 단백질 작용은 동결 될 수 있으므로 저온 결정학에서 검출 할 수 없습니다. 이 장치는 광 유도 신호 전달 과정 및 산화 환원 변화를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
소수의 장치만이 완전하고 중복된 데이터 세트를 제공합니다. 장치 사전 조립을 시작하려면 샘플 식별을 위해 외부 링에 레이블을 지정합니다. 프로젝트 이름, 장치 번호, 결정화 조건 및 날짜를 원하는 대로 포함합니다.
그런 다음 라벨이 붙은 링을 깨끗한 표면에 거꾸로 놓고 외부 링 안에 하나의 석영 웨이퍼를 놓습니다. 다음으로, 소량의 현미경 침지 오일을 페트리 접시에 붓고 심의 양면이 잘 코팅되도록 오일에 심을 담그십시오. 깨끗한 표면에 심을 두드려 여분의 오일을 제거하십시오.
그런 다음 기름칠 된 심을 첫 번째 석영 웨이퍼 위에 놓습니다. 단백질 용액과 결정화 완충액을 피펫을 사용하여 제1 석영 웨이퍼 상에 혼합한다. 혼합 할 때 기포를 피하십시오.
결정화 용액의 총 부피는 심 크기 및 두께에 의해 결정된 결정화 챔버의 최대 용량을 초과해서는 안됩니다. 두 번째 석영 웨이퍼를 혼합 용액 위에 놓습니다. 솔루션은 자발적으로 퍼질 것입니다.
그런 다음 두 번째 석영 웨이퍼를 가장자리에 가볍게 두드려 공기를 밀어내면서 오일을 퍼뜨립니다. 고정 링을 외부 링에 나사로 고정하여 장치를 고정합니다. 필요한 경우 조임 도구를 사용하십시오.
섬세한 석영 웨이퍼가 변형되거나 균열될 수 있으므로 과도하게 조이지 마십시오. 조립 된 장치를 실온 또는 온도 조절 인큐베이터 내부의 상자에 보관하십시오. 몇 시간 또는 며칠 후 결정화 장치를 현미경 아래에 놓고 결정 성장을 모니터링합니다.
필요한 경우 원고에 설명 된대로 결정화 조건을 최적화하십시오. 보정을 위해 칩 홀더에 얇은 YAG 크리스탈을 설치 한 다음 빔 스톱을 설치하십시오. 그런 다음 Insitux 소프트웨어를 열고 표시된 프로그램을 실행하여 장치가 결정화 장치 및 장치에 대해 사용자가 선택한 이름인 직접 빔의 X선 형광 이미지를 촬영합니다.
param은 장치별 컨트롤 매개 변수를 포함하는 파일 이름입니다. 그런 다음 화상 이미지가 X선 형광 이미지의 파일 이름인 빔 프로파일 피팅 프로그램을 실행하여 직접 X선 빔의 정확한 위치를 찾습니다. 광학 스캐닝의 경우 결정화 장치를 칩 홀더에 놓고 나비 나사를 사용하여 고정합니다.
그런 다음 칩 홀더를 운동학 메커니즘을 통해 회절계의 변환 단계에 장착합니다. 단백질 샘플의 감광도와 실험 목적에 따라 백색 또는 적외선 광원을 설치하여 장치의 광학 창에서 현미경 사진을 찍습니다. 설정이 준비되면 빔 라인에서 이동 중인 스캔을 위해 표시된 명령을 입력하여 스캔 프로그램을 실행합니다.
그런 다음 사용자 컴퓨터에서 바둑판식 배열 프로그램을 실행합니다. 여기서 x는 열의 초기 값이고 y는 현미경 사진의 불량 변위에 대한 초기 값입니다. 이 프로그램은 모든 현미경 사진을 1-3 마이크로 미터 픽셀 해상도의 몽타주로 연결합니다. 현미경 사진을 스티칭 한 후 표시된 명령을 입력하여 결정 찾기 프로그램을 실행하십시오.
이 프로그램은 크리스탈 인식 및 샷 계획을 수행하며이 프로그램의 주요 매개 변수는 특정 크리스탈 선택 및 목표 계획을 가능하게합니다. 광원을 제거하고 빔 스톱을 배치합니다. 그런 다음 직렬 회절에 대한 데이터 수집 프로그램을 실행하십시오.
제안된 명령은 사전 프로그래밍된 시퀀스로 계획된 샷을 방문하여 데이터 수집을 트리거합니다. 각 타겟 크리스탈은 빔 위치로 전위됩니다. 각 정지에서 X선 노출은 예약된 시간 지연에서 레이저 조명 유무에 관계없이 촬영됩니다.
이 연구에서는 증기 확산과 온칩 배치 사이의 결정화 조건을 비교했습니다. 온칩 결정화에 대한 4가지 사례 연구와 석영 장치에서 직접 수집한 대표 데이터 세트가 여기에 시연됩니다. 동적 결정학 실험은 어둠 속에서 4, 352 개의 결정과 빛 조명 후 8, 287 개의 결정으로부터의 데이터를 비교함으로써 원적색 광 수용체 단백질의 광 유도 변화를 밝혀 냈다.
현장 직렬 Laue 회절의 어두운 데이터 세트는 전자 밀도를 더 잘 분해하여 모든 Z 기호 형태에서 빌린 발색단의 확실한 모델 구축을 가능하게 했습니다. 빛으로 인한 차이 맵은 중앙 베타 시트에서 공동 운동을 밝혀 발색단의 피롤 고리와 여러 방향족 잔기 사이의 파이-파이 스태킹의 중요성을 시사합니다. 이 플랫폼을 Insitux라고 합니다.
이 플랫폼의 독특한 장점은 결정화가 완료되면 결정 조작을 할 필요가 없다는 것입니다. 단백질 움직임을 포착하기 위해 변화하는 조건에서 많은 데이터 세트를 수집해야 합니다. 그리고 Insitux는 실온에서 수천 개의 단백질 결정에서 대규모 데이터 수집이 가능하기 때문에 이것이 가능합니다.
결정학을 포함한 이 새로운 기능을 사용하면 장치 내부에서 빛에 민감한 시스템을 트리거할 수 있으며 수정 대 수정 장치가 유출로 변환되는 경우 광 불활성 시스템을 연구할 수 있습니다.
