Ce protocole démontre la cristallisation des protéines sur un dispositif semblable à une puce dans la collecte de données de diffraction des rayons X. Ce dispositif est appelé cristal sur cristal parce que les cristaux de protéines se développent sur un seul cristal de quartz. Après la croissance réussie des cristaux de protéines sur de tels dispositifs, des milliers d’images de diffraction sont collectées à partir de chaque dispositif à température ambiante sans même toucher les cristaux de protéines.
La diffraction des rayons X à température ambiante est essentielle pour étudier la fonction des protéines impliquant de nombreux états conformationnels. Ces changements protéiques informatifs ou ces actions protéiques peuvent être congelés, donc non détectables en cryocristallographie. Ces dispositifs peuvent être utilisés pour étudier les processus de signalisation induits par la lumière et les changements redox.
Seule une poignée d’appareils fournit des ensembles de données complets et redondants. Pour commencer le pré-assemblage de l’appareil, étiquetez la bague extérieure pour l’identification de l’échantillon. Incluez le nom du projet, le numéro de l’appareil, l’état de cristallisation et la date souhaitée.
Ensuite, placez l’anneau étiqueté à l’envers sur une surface propre et placez une plaquette de quartz à l’intérieur de l’anneau extérieur. Ensuite, versez une petite quantité d’huile d’immersion pour microscope dans une boîte de Petri et trempez une cale dans l’huile en veillant à ce que les deux côtés de la cale soient bien enduits. Enlevez tout excès d’huile en tamponnant la cale sur une surface propre.
Placez ensuite la cale huilée sur la première plaquette de quartz. Mélanger la solution protéique et le tampon de cristallisation sur la première plaquette de quartz à l’aide d’une pipette. Essayez d’éviter les bulles d’air lors du mélange.
Le volume total de la solution de cristallisation ne doit pas dépasser la capacité maximale de la chambre de cristallisation déterminée par la taille et l’épaisseur de la cale Placez la deuxième plaquette de quartz sur la solution mélangée. La solution se répandra spontanément.
Ensuite, tapotez légèrement la deuxième tranche de quartz sur le bord pour aider à répandre l’huile tout en expulsant l’air. Fixez l’appareil en vissant une bague de retenue dans la bague extérieure. Si nécessaire, utilisez un outil de serrage.
Évitez de trop serrer car cela pourrait provoquer la déformation ou la fissuration des plaquettes de quartz délicates. Conservez les appareils assemblés dans une boîte à température ambiante ou à l’intérieur d’un incubateur à température contrôlée. Après quelques heures ou quelques jours, placez le dispositif de cristallisation sous un microscope et surveillez la croissance des cristaux.
Si nécessaire, optimiser les conditions de cristallisation telles que décrites dans le manuscrit. Pour l’étalonnage, installez un cristal YAG mince sur le porte-puce, puis installez la butée du faisceau. Ensuite, ouvrez le logiciel Insitux et exécutez le programme indiqué pour prendre des images de fluorescence X du faisceau direct où le dispositif est un nom sélectionné par l’utilisateur pour le dispositif de cristallisation et le dispositif.
param est le nom de fichier qui contient les paramètres de contrôle spécifiques au périphérique. Ensuite, trouvez la position précise du faisceau de rayons X direct en exécutant le programme d’ajustement du profil de faisceau où l’image de gravure est le nom de fichier de l’image de fluorescence X. Pour le balayage optique, placez un dispositif de cristallisation dans le porte-puce et fixez-le à l’aide d’une vis à molette.
Montez ensuite le porte-puce sur l’étage de translation du diffractomètre à l’aide d’un mécanisme cinématique. Selon la sensibilité à la lumière de l’échantillon de protéines et le but de l’expérience, installez une source de lumière blanche ou infrarouge pour prendre des micrographies à partir de la fenêtre optique de l’appareil. Une fois la configuration prête, exécutez le programme de numérisation en entrant la commande indiquée pour la numérisation en mouvement sur la ligne de faisceau.
Exécutez ensuite le programme de mosaïque sur un ordinateur utilisateur où x est la valeur initiale de la colonne et y est la valeur initiale des déplacements non autorisés des micrographies. Le programme assemble toutes les micrographies dans un montage d’une résolution de pixel d’un à trois micromètres. Après avoir assemblé les micrographies, entrez la commande indiquée pour exécuter le programme de recherche de cristaux.
Ce programme effectue la reconnaissance des cristaux et la planification des tirs et les paramètres clés de ce programme permettent une sélection de cristaux spécifiques et une planification de la cible. Retirez la source lumineuse et positionnez la butée du faisceau. Exécutez ensuite le programme de collecte de données pour la diffraction série.
La commande suggérée déclenche la collecte de données en visitant les plans planifiés dans une séquence préprogrammée. Chaque cristal ciblé est transloqué vers la position du faisceau. À chaque arrêt, l’exposition aux rayons X est prise avec ou sans éclairage laser à un délai prévu.
Dans l’étude, les conditions de cristallisation entre la diffusion de vapeur et un lot sur puce ont été comparées. Quatre études de cas de cristallisation sur puce et des ensembles de données représentatifs recueillis directement à partir de dispositifs à quartz sont présentés ici. Les expériences de cristallographie dynamique ont révélé des changements induits par la lumière dans la protéine photoréceptrice rouge lointaine en comparant les données de 4 352 cristaux dans l’obscurité et de 8 287 cristaux après éclairage lumineux.
L’ensemble de données sombres de la diffraction de Laue en série in situ a permis d’obtenir des densités électroniques mieux résolues, permettant la construction de modèles fiables d’un chromophore de bilin dans une conformation de signe Z entière. Les cartes des différences induites par la lumière ont révélé des mouvements concertés dans la feuille bêta centrale suggérant l’importance de l’empilement pi-pi entre les anneaux pyrrole du chromophore et plusieurs résidus aromatiques. Cette plateforme s’appelle Insitux.
L’avantage unique de cette plate-forme est que l’on n’a pas à faire de manipulation de cristaux une fois la cristallisation terminée. Il est nécessaire de collecter de nombreux ensembles de données dans des conditions changeantes pour capturer les mouvements des protéines. Et cela devient possible avec Insitux car il permet la collecte de données à grande échelle à partir de milliers de cristaux de protéines à température ambiante.
Avec cette nouvelle capacité incluant la cristallographie, les systèmes sensibles à la lumière peuvent être déclenchés à l’intérieur de l’appareil et le système inerte de lumière peut être étudié si le dispositif cristal sur cristal est converti en flux sortants.
