الهدف من هذا البروتوكول هو الكشف عن المستقلبات الفينولية في البلازما بطريقة UPLC-MS/MS شبه المستهدفة. تم ترسيب بروتينات البلازما مع الإيثانول والعينات المركزة ، وإعادة تعليقها في المرحلة المتنقلة ، قبل الحقن في معدات UPLC. تم تحديد المركبات باستخدام مكتبة شبه مستهدفة تم تجميعها في المختبر ، باستخدام مدير PCDL للاستقلاب والبرامج وقواعد البيانات المجانية المختلفة عبر الإنترنت.
قمنا بتنفيذ تدخل غذائي مع الكعك والمشروبات التي صيغت مع دقيق بذور بروسيموم أليكاستروم. في نهاية التدخل ، تم تحسين الحالة الغذائية والساركوبينية للمشاركين ، وتم زيادة إجمالي المحتوى الفينولي للبلازما. لكننا بحاجة إلى تحديد المركبات الفينولية التي تم امتصاصها وساهمت في التأثير الإيجابي.
إن تحديد المركبات الفينولية التي يتم امتصاصها بعد استهلاك الأطعمة الغنية بمضادات الأكسدة هذه مهمة صعبة ولكنها ضرورية ، إذا أردنا إثبات النشاط البيولوجي لهذه المواد الكيميائية النباتية. التوافر البيولوجي لمعظم المكونات الفينولية منخفض ، علاوة على ذلك ، يدخل أقل من 5٪ منها دون تحول هيكلي إلى بلازما. يمر معظمها بالعديد من التحولات الحيوية ، مثل المثيلة أو السلفونات أو الغلوكورونيدات.
حددت مجموعة واسعة من الدراسات المستقلبات الأكثر شيوعا في السوائل الحيوية بواسطة UPLC-MS و UPLC-MS / MS. ومع ذلك ، لا يتم الإبلاغ عن جزء كبير من مستقلب البكتيريا لعدم وجود قواعد بيانات تحتوي على معلوماتها الكاملة. تحديد الأيض معقد بسبب التكلفة والتوافر التجاري لمعايير الأيض.
لذلك ، قد تكون أفضل استراتيجية غير مستهدفة أو شبه مستهدفة تحليل مستقلب MS / MS. يعتمد هذا التحليل على استخدام معلومات المعالم الجزيئية ، والكتلة الدقيقة أحادية النظير لنسبة الكتلة إلى الشحنة ، والتوزيع النظيري ، ونمط التجزئة. لتحديد الهوية الكيميائية ومقارنتها بقواعد البيانات المجانية المتاحة على الإنترنت التي تحتوي على مستقلبات البوليفينول المحددة في السوائل الحيوية بعد استهلاك الوجبات الغذائية الغنية بالبوليفينول.
في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير طريقة UPLC-MS / MS شبه المستهدفة لتحليل عينات البلازما لمجموعة من كبار السن المشاركين في التدخل الغذائي. تخزين عينات البلازما عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى التحليل. تذويب عينات البلازما في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة أو عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.
ضع 200 ميكرولتر من عينة البلازما في أنبوب ميكروبي مليمترين واخلطه مع 1000 ميكرولتر من الإيثانول النقي. دوامة عينة البلازما لمدة 30 ثانية. عينة جهاز طرد مركزي في 6،580 قوة الطرد المركزي لمدة خمس دقائق.
بعد الطرد المركزي ، قم بجمع supernatant باستخدام ماصة دقيقة أو ماصة باستور ووضعها في أنبوب دقيق جديد. حجز السوبرناتانت. امزج حبيبة مع 1000 ميكرولتر من الإيثانول النقي ، وقمة الرأس لمدة 30 ثانية ، ثم جهاز طرد مركزي في نفس الظروف.
جمع supernatant وتخلط مع أول supernatant. قم بإزالة الإيثانول من العينة باستخدام النيتروجين النقي عند 135 رطل لكل بوصة مربعة. احتفظ بالإبرة على بعد سنتيمتر واحد من الجزء العلوي من الأنبوب الدقيق لمنع فقدان العينة وتدفقها حتى تجف العينة.
إعادة تعليق العينات الجافة في 100 ميكرولتر من واحد هو خليط واحد من الأسيتونيتريل مع الماء. تصفية من خلال غشاء حقنة نايلون 45 دقيقة مباشرة في إدراج قارورة HPLC الصغيرة حقن ثلاثة ميكرولترات من العينة على UPLC مجهزة بعمود C 18 العكسي المرحلة. اضبط درجة حرارة جهاز أخذ العينات التلقائي على 20 درجة مئوية وترموستات العمود على 25 درجة مئوية.
حقن كل عينة في ثلاثة أضعاف. استخدم 0.1٪ حمض الفورميك في الماء كمذيب A ، و 100٪ acetonitrile كمذيب B.اضبط معدل التدفق عند 0.4 ملم في الدقيقة وبرنامج تدرج على النحو التالي ، من صفر إلى دقيقة واحدة 10٪ B ، من دقيقة إلى أربع دقائق 30٪ B ، من أربع إلى ست دقائق 38٪ B ، من ست إلى ثماني دقائق 60٪ B ، من ثماني إلى 8.5 دقائق 60٪ B ، 8.5 إلى تسع دقائق 10٪ B. اضبط مطياف الكتلة في تأين الوضع السالب.
استخدم النيتروجين كغاز تجفيف عند 300 درجة مئوية ومعدل تدفق عند 13 لترا في الدقيقة. اضبط ضغط البخاخات عند 30 رطل لكل بوصة مربعة. اضبط الجهد الشعري على 4000 فولت، وجهد الشظايا عند 175 فولت، وجهد القاشطة على 65 فولت.
امسح الكتل بين 100 و1100 m/z وبالنسبة لقياس الطيف الكتلي، امسح الكتل بين 50 إلى 1000 m/z. قم بتعيين الحصول على البيانات في وضع MS/MS التلقائي. استخدم الكتلة المرجعية التالية، 119.036 و966.0007.
ابحث عن المركبات الفينولية والمستقلبات الفينولية وغيرها من المركبات ذات الأهمية في الأدبيات العلمية. افتح برنامج إدارة قواعد البيانات المضمن في نظام UPLC. حدد ملفا، ثم حدد مكتبة مركبة جديدة لقاعدة البيانات الشخصية، PCDL.
ثم حدد ، إنشاء PCDL جديد. حدد نوع مستقلبات PCDL LC / MS. تعيين اسم PCDL.
ثم حدد إنشاء. في شريط الأدوات، حدد PCDL ثم خيار السماح بالتحرير. ثم انقر فوق الزر البحث عن مركبات.
يمكن إضافة المركبات إلى المكتبة الشخصية بطريقتين ، الأولى عن طريق نسخها من المكتبة العامة للأداة. للقيام بذلك ، افتح قاعدة بيانات الأدوات الموجودة في إدارة البيانات حتى الآن. انقر فوق الزر البحث عن المركبات.
في خيار البحث الفردي، أدخل معايير البحث المركب للعثور على مركب الاهتمام. في جدول النتائج المركبة، حدد مركب الاهتمام. لتحديد أكثر من مركب واحد، انقر فوق المركب الأول، ثم اضغط باستمرار على المفتاح CTRL، ثم انقر فوق كل مركب ذي أهمية.
ثم انقر بزر الماوس الأيمن على جميع المركبات المميزة وحدد إلحاق ب PCDL. في النافذة الجديدة ، ابحث عن ملف قاعدة البيانات الشخصية المتخصصة وحدده. ضع علامة على المربع بما في ذلك أطياف للمركب إذا كان موجودا.
انقر فوق الزر إلحاق. في مربع الحوار الجديد، حدد نعم للتحقق من المركبات الجديدة المضافة. حدد لا لمواصلة البحث عن المزيد من المركبات ذات الاهتمام.
ثانيا، يمكن إضافة مركبات جديدة يدويا إذا لم تكن متوفرة في المكتبة العامة للأداة. لهذا فتح ، قاعدة البيانات الشخصية المتخصصة. بمجرد فتحه ، حدد PCDL ، ثم خيار السماح بالتحرير.
حدد خيار تحرير المركبات. انقر فوق الزر إضافة جديد. في القسم العلوي من النافذة ، أكمل معلومات المركب الجديد.
املأ الصيغة والاسم واسم IUPAC ورقم CAS ومعرف Chemspider والمعرفات الأخرى. باستخدام المعلومات المتاحة في المكتبات المجانية عبر الإنترنت ، Chemspider ، PubChem ، و Phenol Explorer لملء معلومات المركب الجديد محل الاهتمام. بمجرد الانتهاء ، انقر فوق الزر حفظ كجديد لحفظ المعلومات المركبة الجديدة في قاعدة البيانات الشخصية المتخصصة.
كرر العملية مع جميع المركبات التي تهمك لاستكمال قاعدة البيانات الشخصية المتخصصة. استخدم برنامج المدير النوعي للأداة لتحديد المركبات الفينولية والأيضات الفينولية. افتح نموذج الملف.
في لوحة Chromatogram، حدد تعريف Chromatograms واستخرج كروماتوجرام الأيونات الكلي TIC، وكروماتوجرام الأيونات المستخرجة من MS EIC وEIC من MS/MS. حدد خيار دمج الكروماتوجرام. في لوحة البحث عن مركبات، حدد بحث حسب خيارات الصيغة.
في النافذة الجديدة، حدد مصدر الصيغة ثم خيار مكتبة الشرطة المائلة لقاعدة البيانات. ابحث عن قاعدة البيانات الشخصية التي تم إنشاؤها مسبقا وانقر على فتح. حدد خيار مطابقة الصيغة واضبط تسامحا مع المطابقة الجماعية لخمسة أجزاء في المليون، جزء في المليون.
حدد خيار الأيونات السالبة وحدد فقط مربع الحوار ناقص H. في خيار النتائج، ضع علامة على مستخلص EIC، واستخرج الطيف الذي تم تنظيفه، واستخرج الطيف الخام، وقم بتضمين مربعات حوار منظمة. حدد خيار فلاتر النتائج.
ثم ضع علامة تحذير إذا كانت النتيجة ، ثم قم بتعيين مطابقة النتيجة عند 80٪ ثم ضع علامة لا تتطابق إذا كانت النتيجة وتعيين النتيجة عند 75٪ ثم انقر على البحث عن المركبات حسب الصيغة لتحديد المركبات ذات الأهمية في العينة. ويوضح الشكل التالي العملية خطوة بخطوة لتحديد المستقلبات الفينولية من خلال تحليل UPLC MS/MS شبه المستهدف لعينات البلازما. أولا ، تم الحصول على إجمالي كروماتوجرام الأيونات باستخدام قاعدة بيانات PCDL ذاتية الإنشاء تحتوي على 645 مركبا فينوليا ومستقلباتها ، تم الحصول عليها من قواعد بيانات مجانية عبر الإنترنت.
بعد ذلك ، تم الحصول على كروماتوغرام الأيونات المستخرجة ونمط التجزئة ، أو الأيونات ذات الكتلة الأقل من خمسة أجزاء في المليون ، وتحمل المطابقة. وأخيرا، تمت مقارنة التوزيع النظيري للقمم المكتشفة بتوزيع المركبات النظرية. من هذا التحليل ، تم تحديد ما مجموعه 25 مركبا فينوليا ومستقلبات في عينات البلازما.
لتقييم فعالية طريقة التصميم في تحديد المركبات الفينولية الممتصة أو مستقلباتها ، تم تحليل خمس عينات من المشاركين في الدراسة تم الحصول عليها قبل وبعد التدخل لمدة 30 يوما. تم حساب الوفرة النسبية لكل مركب عن طريق قسمة المساحة تحت المنحنى بعد المعالجة من قبل AUC قبل العلاج. ويبين الجدول الرابع قائمة ب 12 مركبا من مركبات الفينول التي أظهرت زيادة في البلازما بعد استهلاك الأطعمة المحتوية على دقيق الليكاستروم لمدة 30 يوما.
كان حمض Phenylacetic مستقلب فقط تم العثور عليه باستمرار بتركيز أعلى بعد العلاج. زاد الجليسيتين ، وهو ايسوفلافون جليكوزيل ، وثلاثة حمض هيدروكسي فينيل فاليريك في ثلاث من العينات الخمس ، لكنه انخفض في العينتين الأخريين. تم اكتشاف Gomisin M2 ، وهو قشور ، في ثلاث من العينات الخمس فقط بعد التدخل الغذائي.
تم العثور على المركبات الفينولية الأخرى والمستقلبات فقط في عينة واحدة وفقط بعد العلاج. وتبين الطريقة التي وضعت هذه الورقة أنها كانت في معظم أجزائها مناسبة تماما للهدف الذي أنشئت من أجله. كانت العينة لكل علاج بسيطة وفعالة.
تم تحقيق فصل UPLC وتحديد MS / MS شبه المستهدف للمستقلبات الفينولية.
