O objetivo deste protocolo é detectar metabólitos fenólicos no plasma por um método UPLC-MS/MS semi-direcionado. As proteínas plasmáticas foram precipitadas com etanol e amostras concentradas, e reinsupedas na fase móvel, antes da injeção no equipamento UPLC. Os compostos foram identificados por meio de uma biblioteca semi-direcionada montada no laboratório, utilizando o gerente de PCDL para metabolômica, software e diferentes bancos de dados online gratuitos.
Implementamos uma intervenção nutricional com uma formulação de muffin e bebidas com farinha de sementes de alicastrum de brosimum. Ao final da intervenção, o estado nutricional e sarcopênico dos participantes foi melhorado, e o teor fenólico total do plasma foi aumentado. Mas precisamos identificar quais compostos fenólicos foram absorvidos e contribuíram para o efeito positivo.
A identificação e quantificação dos compostos fenólicos que são absorvidos após o consumo de alimentos ricos nesses antioxidantes é tarefa difícil, mas necessária, se for para demonstrar atividade biológica desses fitoquímicos. A biodisponibilidade da maioria dos componentes fenólicos é baixa, além disso, menos de 5% deles entram sem transformação estrutural em plasma. A maioria passa por várias biotransformações, como metilação, sulfonação ou glucuronidação.
Uma ampla gama de estudos identificou os metabólitos mais comuns em biofluidos por UPLC-MS e UPLC-MS/MS. No entanto, grande parte do metabólito da bactéria não é relatado à falta de bancos de dados que contenham suas informações completas. A identificação metabólica é complicada pelo custo e disponibilidade comercial das normas metabólitos.
Portanto, a melhor estratégia pode ser a análise metabólica MS/MS sem alvo ou semi-direcionada. Esta análise baseia-se no uso de informações de características moleculares, massa para taxa de carga de massa exata monoisotópica, distribuição isotópica e padrão de fragmentação. Para determinar a identidade química e compará-la com bancos de dados on-line disponíveis gratuitamente que contêm metabólitos polifenóis identificados em biofluidos após o consumo de dietas ricas em polifenóis.
No presente estudo, desenvolvemos um método uplc-MS/MS semi-direcionado para analisar as amostras de plasma de um grupo de idosos envolvidos em uma intervenção nutricional. Armazene amostras de plasma a menos 80 graus Celsius até a análise. Descongele amostras de plasma à temperatura ambiente por 15 minutos ou a 37 Celsius por cinco minutos.
Coloque 200 microliters de amostra de plasma em um microtubo de dois milímetros e misture com 1000 microliters de etanol puro. Amostra de plasma de vórtice por 30 segundos. Amostra de centrífuga a 6.580 força centrífuga por cinco minutos.
Após a centrifugação, colete o supernatante com uma micropipette ou pipeta Pasteur e coloque-o em um novo microtubo. Reserve o supernatante. Misture uma pelota com 1000 microliters etanol puro, vértice por 30 segundos e, em seguida, centrífuga nas mesmas condições.
Colete o supernatante e misture com o primeiro supernante. Remova o etanol da amostra usando nitrogênio puro a 135 psi. Mantenha a agulha a um centímetro de distância do topo do microtubo para evitar a perda da amostra e lave até que uma amostra esteja seca.
Resuspend amostras secas em 100 microliters de um é para uma mistura de acetonitrilo com água. Filtre através de uma membrana de seringa de nylon de 45 micro diretamente em uma micro inserção de frasco HPLC Insira três microliters de amostra no UPLC equipados com uma coluna de fase reversa C 18. Coloque a temperatura do autosampler em 20 Celsius e o termostato da coluna a 25 Celsius.
Injete cada amostra em triplicado. Use ácido fórmico de 0,1% na água como solvente A, e 100% acetonitrilo como solvente B.Coloque a taxa de fluxo em 0,4 milímetros por minuto e um programa de gradiente da seguinte forma, de zero a um minuto 10%B, de um a quatro minutos 30%B, de quatro a seis minutos 38%B, de seis a oito minutos 60% B, oito a 8,5 minutos 60% B, 8,5 a nove minutos 10%B. Coloque o espectrômetro de massa em ionização de modo negativo.
Use nitrogênio como gás de secagem a 300 Celsius e vaze a 13 litros por minuto. Coloque a pressão do nebulizador em 30 psi. Coloque uma tensão capilar a 4.000 volts, tensão fragmentor a 175 volts e tensão skimmer a 65 volts.
Escaneie as massas entre 100 e 1100 m/z e para a espectrometria de massa, escaneie massas entre 50 a 1000 m/z. Defina a aquisição de dados no modo MS/MS automático. Utilize a seguinte massa de referência, 119.036 e 966.0007.
Busca por compostos fenólicos, metabólitos fenólicos e outros compostos de interesse pela literatura científica. Abra o software de gerenciamento de banco de dados incluído no sistema UPLC. Selecione arquivo e selecione nova biblioteca de compostos de banco de dados pessoal, PCDL.
Em seguida, selecione, crie novo PCDL. Selecione o tipo de metabolômica PCDL LC/MS. Defina o nome para PCDL.
Em seguida, selecione criar. Na barra de ferramentas, selecione PCDL e, em seguida, a opção permitir edição. Em seguida, clique no botão encontrar compostos.
Os compostos podem ser adicionados à biblioteca pessoal de duas maneiras, primeiro copiando-os da biblioteca geral do instrumento. Para isso, abra os instrumentos existentes no banco de dados incluídos na gestão de dados até agora. Clique no botão encontrar compostos.
Na única opção de pesquisa, insira os critérios de pesquisa compostos para encontrar o composto de interesse. Na tabela de resultados compostos, selecione o composto de juros. Para selecionar mais de um composto, clique no primeiro composto e, em seguida, segure a tecla CTRL e, em seguida, clique em cada composto de interesse.
Em seguida, clique com o botão direito do mouse em todos os compostos destacados e selecione Apêndice para PCDL. Na nova janela, pesquise e selecione o arquivo especializado de banco de dados pessoal. Marque a caixa inclua espectros para compostos se presentes.
Clique no botão Anexar. Na nova caixa de diálogo, selecione Sim para verificar os novos compostos adicionados. Selecione Não para continuar procurando por mais compostos de interesse.
Em segundo lugar, novos compostos podem ser adicionados manualmente se não estiverem disponíveis na biblioteca geral do instrumento. Para isso aberto, o banco de dados pessoal especializado. Uma vez aberto, selecione PCDL e, em seguida, a opção permitir edição.
Selecione a opção compostos de edição. Clique no novo botão adicionar. Na parte superior da janela, complete as informações do novo composto.
Preencha a fórmula, nome, nome IUPAC, número CAS, ID Chemspider e outros identificadores. Usando informações disponíveis nas bibliotecas online gratuitas, Chemspider, PubChem e Phenol Explorer para preencher as informações do novo composto de interesse. Uma vez terminado, clique no botão salvar como novo para salvar as novas informações do composto no banco de dados pessoal especializado.
Repita o processo com todos os compostos de interesse para concluir o banco de dados pessoal especializado. Use o software qualitativo do instrumento para identificar compostos fenólicos e metabólitos fenólicos. Abra o arquivo de amostra.
No painel Cromatógrama, selecione definir Cromatógramas e extrair o cromatógrama de íon total TIC, íon-cromatgrama extraído de MS EIC e EIC de MS/MS. Selecione a opção de cromatograma de íon integrado. No painel encontrar compostos, selecione encontrar por opções de fórmula.
Na nova janela, selecione a fonte de fórmula e, em seguida, a opção de biblioteca de corte de banco de dados. Encontre o banco de dados pessoal criado anteriormente e clique em aberto. Selecione a opção de correspondência de fórmulas e defina uma tolerância de correspondência em massa de cinco partes por milhão, ppm.
Selecione a opção íons negativos e selecione apenas a caixa de diálogo menos H. Na opção de resultados, marque o extrato de EIC, extraia espectro limpo, extraia espectro bruto e inclui caixas de diálogo estruturadas. Selecione a opção filtros de resultados.
E então marque avisar se a pontuação for, em seguida, definir a pontuação match em 80%Em seguida, a marca não corresponder se a pontuação é e definir a pontuação em 75%Em seguida, clique nos compostos de encontrar por fórmula para identificar compostos de interesse na amostra. O processo passo a passo para a identificação de metabólitos fenólicos através da análise semi-direcionada UPLC MS/MS de amostras de plasma é mostrado na próxima figura. Primeiro, o total de íon-cromatgrama foi obtido utilizando-se um banco de dados PCDL auto-criado que continha 645 compostos fenólicos e seus metabólitos, obtidos a partir de bancos de dados on-line gratuitos.
Em seguida, o padrão de extração de íon-cromatógrafo e fragmentação, ou os íons com menos de cinco ppm de massa, foram obtidos tolerância de correspondência. Finalmente, a distribuição isotópica dos picos detectados foi comparada com a dos compostos teóricos. A partir desta análise, foram identificados 25 compostos fenólicos e metabólitos nas amostras de plasma.
Para avaliar a eficácia do método de desenho na identificação dos compostos fenólicos absorventes ou seus metabólitos, foram analisadas cinco amostras dos participantes do estudo obtidas anteriormente e após a intervenção de 30 dias. A abundância relativa de cada composto foi calculada dividindo a área sob a curva após o tratamento por AUC antes do tratamento. A tabela quatro mostra a lista de 12 compostos de fenol que mostraram um aumento no plasma após o consumo de 30 dias da farinha de alicastrum de brosimum contendo alimentos.
O ácido fenílaceso foi apenas metabólito encontrado consistentemente em maior concentração após o tratamento. Glycitin, uma isoflavona glicosilada, e três ácidos hidroxifenilvalericos aumentaram em três das cinco amostras, mas diminuíram nas outras duas. Gomisin M2, um lignan, foi detectado em três das cinco amostras somente após a intervenção nutricional.
Os outros compostos fenólicos e metabólitos foram encontrados apenas em uma amostra e somente após o tratamento. O método desenvolvido presente, mostra que na maioria das partes foi bem adequado para o objetivo para o qual foi criado. A amostra por tratamento foi simples e eficaz.
Foram realizadas separação DA UPLC e identificação semi-direcionada de metabólitos fenólicos.
