El objetivo de este protocolo es detectar metabolitos fenólicos en plasma mediante un método semi-dirigido UPLC-MS/MS. Las proteínas plasmáticas se precipitaron con etanol y se concentraron muestras, y se volvieron a suspender en la fase móvil, antes de la inyección en el equipo UPLC. Los compuestos se identificaron utilizando una biblioteca semi dirigida ensamblada en el laboratorio, utilizando el administrador PCDL para metabolómica, software y diferentes bases de datos en línea gratuitas.
Implementamos una intervención nutricional con un muffin y una bebida formulada con harina de semilla de brosimum alicastrum. Al final de la intervención, se mejoró el estado nutricional y sarcopénico de los participantes, y se aumentó el contenido fenólico total de plasma. Pero necesitamos identificar qué compuestos fenólicos habían sido absorbidos y aportado el efecto positivo.
La identificación y cuantificación de los compuestos fenólicos que se absorben después del consumo de alimentos ricos en estos antioxidantes es una tarea difícil pero necesaria, si se quiere demostrar la actividad biológica de estos fitoquímicos. La biodisponibilidad de la mayoría de los componentes fenólicos es baja, además menos del 5% de ellos entran sin transformación estructural en plasma. La mayoría pasan por varias biotransformaciones, como la metilación, la sulfonación o la glucuronidación.
Una amplia gama de estudios identificó los metabolitos más comunes en biofluidos por UPLC-MS y UPLC-MS/MS. Sin embargo, una gran parte del metabolito de la bacteria no se reporta a la falta de bases de datos que contengan su información completa. La identificación de metabolitos se complica por el costo y la disponibilidad comercial de los estándares de metabolitos.
Por lo tanto, la mejor estrategia puede ser el análisis de metabolitos de EM/EM no dirigido o semidirigido. Este análisis se basa en el uso de información de características moleculares, masa a relación de carga monoisotópica masa exacta, distribución isotópica y patrón de fragmentación. Determinar la identidad química y compararla con bases de datos en línea disponibles gratuitamente que contienen metabolitos de polifenoles identificados en biofluidos después del consumo de dietas ricas en polifenoles.
En el presente estudio, hemos desarrollado un método SEMI-dirigido UPLC-MS/MS para analizar las muestras plasmáticas de un grupo de personas mayores involucradas en una intervención nutricional. Almacene las muestras de plasma a menos 80 grados centígrados hasta el análisis. Descongele las muestras de plasma a temperatura ambiente durante 15 minutos o a 37 grados centígrados durante cinco minutos.
Coloque 200 microlitros de muestra de plasma en un microtubo de dos milímetros y mezcle con 1000 microlitros de etanol puro. Muestra de plasma de vórtice durante 30 segundos. Muestra de centrífuga a 6, 580 fuerza centrífuga durante cinco minutos.
Después de la centrifugación, recoja el sobrenadante con una micropipeta o pipeta Pasteur y colóquelo en un nuevo microtubo. Reserva el sobrenadante. Mezcle un pellet con 1000 microlitros de etanol puro, vértice durante 30 segundos y luego centrífuga en las mismas condiciones.
Recoge el sobrenadante y mézclalo con el primer sobrenadante. Retire el etanol de la muestra usando nitrógeno puro a 135 psi. Mantenga la aguja a un centímetro de distancia de la parte superior del microtubo para evitar la pérdida de muestra y enjuague hasta que la muestra esté seca.
Resuspend muestras secas en 100 microlitros de uno es a una mezcla de acetonitrilo con agua. Filtre a través de una membrana de jeringa de 45 micro nylon directamente en un micro inserto de vial de HPLC Inyecte tres microlitros de muestra en UPLC equipado con una columna de fase inversa C 18. Ajuste la temperatura del muestreador automático a 20 grados centígrados y el termostato de columna a 25 grados centígrados.
Inyecte cada muestra por triplicado. Use ácido fórmico 0.1% en agua como solvente A, y 100% acetonitrilo como solvente B.Establezca el caudal en 0.4 milímetros por minuto y un programa de gradiente de la siguiente manera, cero a un minuto 10%B, uno a cuatro minutos 30%B, cuatro a seis minutos 38%B, seis a ocho minutos 60%B, ocho a 8.5 minutos 60%B, 8.5 a nueve minutos 10%B. Ajuste el espectrómetro de masas en modo de ionización negativa.
Use nitrógeno como gas de secado a 300 grados Celsius y caudal a 13 litros por minuto. Ajuste la presión del nebulizador a 30 psi. Establezca un voltaje capilar a 4, 000 voltios, un voltaje de fragmentor a 175 voltios y un voltaje skimmer a 65 voltios.
Escanee las masas entre 100 y 1100 m/z y para la espectrometría de masas, escanee masas entre 50 y 1000 m/z. Establezca la adquisición de datos en modo Auto MS/MS. Utilice la siguiente masa de referencia, 119.036 y 966.0007.
Búsqueda de compuestos fenólicos, metabolitos fenólicos y otros compuestos de interés en la literatura científica. Abra el software de gestión de bases de datos incluido en el sistema UPLC. Seleccione archivo y, a continuación, seleccione nueva biblioteca compuesta de base de datos personal, PCDL.
A continuación, seleccione, cree un nuevo PCDL. Seleccione el tipo de metabolómica PCDL LC/MS. Establezca el nombre de PCDL.
A continuación, seleccione crear. En la barra de herramientas, seleccione PCDL y, a continuación, la opción Permitir edición. A continuación, haga clic en el botón Buscar compuestos.
Los compuestos se pueden agregar a la biblioteca personal de dos maneras, primero copiándolos de la biblioteca general del instrumento. Para ello, abra los instrumentos existentes en la base de datos incluida en la gestión de datos hasta el momento. Haga clic en el botón buscar compuestos.
En la opción de búsqueda única, introduzca los criterios de búsqueda de compuestos para encontrar el compuesto de interés. En la tabla de resultados compuestos, seleccione el compuesto de interés. Para seleccionar más de un compuesto, haga clic en el primer compuesto, mantenga presionada la tecla CTRL y, a continuación, haga clic en cada compuesto de interés.
Luego, haga clic derecho en todos los compuestos resaltados y seleccione Anexar a PCDL. En la nueva ventana, busque y seleccione el archivo de base de datos personal especializado. Marque la casilla incluir espectros para compuesto si está presente.
Haga clic en el botón Anexar. En el nuevo cuadro de diálogo, seleccione Sí para comprobar los nuevos compuestos agregados. Seleccione No para seguir buscando más compuestos de interés.
En segundo lugar, se pueden agregar nuevos compuestos manualmente si no están disponibles en la biblioteca general del instrumento. Para ello abierto, la base de datos personal especializada. Una vez abierto, seleccione PCDL y, a continuación, la opción Permitir edición.
Seleccione la opción editar compuestos. Haga clic en el botón Agregar nuevo. En la sección superior de la ventana, complete la información del nuevo compuesto.
Rellene la fórmula, el nombre, el nombre de la IUPAC, el número CAS, el ID de Chemspider y otros identificadores. Utilizando la información disponible en las bibliotecas en línea gratuitas, Chemspider, PubChem y Phenol Explorer para completar la información del nuevo compuesto de interés. Una vez terminado, haga clic en el botón guardar como nuevo para guardar la nueva información compuesta en la base de datos personal especializada.
Repite el proceso con todos los compuestos de interés para completar la base de datos personal especializada. Utilice el software de gestión cualitativa del instrumento para identificar compuestos fenólicos y metabolitos fenólicos. Abra el archivo de ejemplo.
En el panel Cromatograma, seleccione definir Cromatogramas y extraer el cromatograma iónico total TIC, cromatograma iónico extraído de MS EIC y EIC de MS/MS. Seleccione la opción Integrar cromatograma. En el panel Buscar compuestos, seleccione buscar por opciones de fórmula.
En la nueva ventana, seleccione origen de la fórmula y, a continuación, la opción biblioteca de barras diagonales de la base de datos. Encuentre la base de datos personal creada anteriormente y haga clic en abrir. Seleccione la opción de coincidencia de fórmula y establezca una tolerancia de coincidencia de masa de cinco partes por millón, ppm.
Seleccione la opción de iones negativos y seleccione sólo el cuadro de diálogo menos H. En la opción de resultados, marque el EIC de extracción, extraiga el espectro limpio, extraiga el espectro sin procesar e incluya cuadros de diálogo estructurados. Seleccione la opción de filtros de resultados.
Y luego marque advertir si el puntaje es, luego establezca el puntaje coincidente en 80%Luego marque no coincida si el puntaje es y establezca el puntaje en 75%Luego haga clic en buscar compuestos por fórmula para identificar compuestos de interés en la muestra. El proceso paso a paso para la identificación de metabolitos fenólicos a través del análisis semi-dirigido UPLC MS/MS de muestras plasmáticas se muestra en la siguiente figura. En primer lugar, el cromatograma iónico total se obtuvo utilizando una base de datos PCDL autocreada que contenía 645 compuestos fenólicos y sus metabolitos, obtenidos de bases de datos en línea gratuitas.
A continuación, se obtuvo la tolerancia de coincidencia extraída del cromatograma iónico y la fragmentación, o los iones con menos de cinco ppm de masa. Finalmente, se comparó la distribución isotópica de los picos detectados con la de los compuestos teóricos. A partir de este análisis, se identificaron un total de 25 compuestos fenólicos y metabolitos en las muestras de plasma.
Para evaluar la efectividad del método de diseño en la identificación de los compuestos fenólicos absorbentes o sus metabolitos, se analizaron cinco muestras de los participantes del estudio obtenidas antes y después de la intervención de 30 días. La abundancia relativa de cada compuesto se calculó dividiendo el área bajo la curva después del tratamiento por AUC antes del tratamiento. La Tabla cuatro muestra la lista de 12 compuestos fenólicos que mostraron un aumento en el plasma después del consumo de 30 días de los alimentos que contienen harina de brosimum alicastrum.
El ácido fenilacético fue solo un metabolito encontrado consistentemente en mayor concentración después del tratamiento. La glicitina, una isoflavona glicosilada, y tres ácidos hidroxifenilvaléricos aumentaron en tres de las cinco muestras, pero disminuyeron en las otras dos. Gomisin M2, un lignano, se detectó en tres de las cinco muestras solo después de la intervención nutricional.
Los otros compuestos fenólicos y metabolitos se encontraron solo en una muestra y solo después del tratamiento. El método desarrollado en el presente trabajo, muestra que en la mayoría de las partes era muy adecuado para el objetivo para el que fue creado. La muestra por tratamiento fue simple y efectiva.
Se logró la separación de UPLC y la identificación semi-dirigida de MS/MS de metabolitos fenólicos.
