اقتران تحليل التصوير بقع واحد وقوة الجر المجهرية يمكن تحليل الآلات الجزيئية لتقدم مخروط النمو والملاحة. كما تستخدم التقنيات المواد المتاحة تجاريا والمجاهر القياسية. يمكن للباحثين التكيف حرفيا مع التقنيات في دراساتهم.
تبدأ من خلال علاج الخلايا العصبية مع رباعي ميثيل رودامين أو TMR ligand في تخفيف واحد إلى 2000 في وسط الثقافة في اليوم في المختبر 3. ثم الحفاظ على الخلايا العصبية في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة. بعد الحضانة، اغسل TMR ligand ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني دافئ مسبقا.
إزالة برنامج تلفزيوني قبل إضافة 0.5 ملليلتر من المتوسط L-15 ليبوفيتز الدافئة في الخلايا العصبية. الحفاظ على الخلايا العصبية في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، قم بتشغيل مجهر الفلورة وتعيين حاضنة الدولة العليا إلى 37 درجة مئوية.
ثم ضع الخلايا العصبية المعالجة TMR ligand في طبق القاع الزجاجي على حاضنة المرحلة العليا الدافئة. تعيين معلمات الحصول على الصورة مثل وقت التعرض في 500 مللي ثانية لقنوات لايفاكت وهالوتاغ أكتين الفلورية وbinning كما 0.065 ميكرون بنسبة 0.065 ميكرون لكل بكسل في الفاصل الزمني من ثلاث ثوان لمدة 50 إطارا. بعد اختيار مخروط النمو الذي يعبر بقوة Lifeact والأسبوعية يعبر HaloTag-actin.
أغلق الحقل الموجود على الحجاب الحاجز لإلقاء الضوء على منطقة دنيا تتضمن مخروط النمو والحصول على صور الفاصل الزمني. في اليوم في المختبر 3، استبدال المتوسطة الثقافة مع 0.5 ملليلتر من المتوسط L-15 ليبوفيتز الدافئة والحفاظ على الخلايا العصبية لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية. للحصول على المجهر قوة الجر، بدوره على المجهر confocal المسح بالليزر وتعيين حاضنة المرحلة الأعلى إلى 37 درجة مئوية.
ضع الخلايا العصبية على طبق القاع الزجاجي على حاضنة المرحلة العليا التي تم تحذيرها مسبقا. تعيين معلمات الحصول على الصورة كما هو موضح في البرنامج النصي القائمة وحدد مخروط النمو الذي يعبر بقوة عن تعزيز البروتين الفلوري الأخضر أو EGFP. التركيز على سطح هلام والحصول على الصور الفاصل الزمني.
عند الانتهاء من استخدام برنامج معالجة الصور لإنتاج قناة واحدة الوقت الهفوات RGB مداخن الصورة. ثم حفظ الصور كملفات tiff. بعد ذلك، تطبيق 100 ميكرولتر من وزن 10٪ من قبل حجم كبريتات دودسيل الصوديوم أو SDS المذابة في الماء المقطر إلى طبق أسفل الزجاج للاسترخاء الركيزة هلام عن طريق الإفراج عن الخلايا العصبية من الركيزة.
ثم احتضان الطبق في حاضنة المرحلة الأعلى لمدة خمس دقائق في 37 درجة مئوية لتثبيت درجة الحرارة. في المجهر confocal المسح بالليزر، والتركيز على سطح هلام للحصول على صورة من الخرز في الركيزة غير المدربة. إنتاج صورة قناة واحدة RGB من الخرز في الركيزة غير المدربة وحفظ هذه الصورة كملف tiff.
تحميل رمز تحليل قوة الجر TFM2021 وفتح TFM2021 في MATLAB. فتح الرئيسية. m في TFM2021 وتشغيله.
عند ظهور واجهة مستخدم رسومية على الشاشة. انقر على تحميل غير مدربين، صورة الركيزة وحدد موقف X-Y تصحيح صورة حبة في الركيزة غير المدربة. انتقل لتحميل صور حبة الفلورسنت وحدد كومة الفاصل الزمني من حبات الصور.
ثم انقر على تحميل الصور مشرق الميدان لاختيار صورة المكدس الفاصل الزمني من حقل مشرق واستخدام تحميل صور GFP لتحديد صورة المكدس الفاصل الزمني من EGFP. من القائمة المنسدلة على واجهة المستخدم الرسومية، حدد GFP قبل النقر على عائد الاستثمار لتحديد منطقة المستطيل ذات الاهتمام، بما في ذلك مخروط النمو، عن طريق النقر على نقطتين على صورة الخلية المعروضة. مرة واحدة فعلت انقر على زر حفظ على واجهة المستخدم الرسومية لحفظ الصور المكدس المحدد جنبا إلى جنب مع عائد الاستثمار في ملف حصيرة.
بعد ذلك، انقر فوق اكتشاف موضع وإدخال القيمة المطلوبة في مربع الحوار لتحديد عتبة للكشف عن حبة. ضرب بخير لبدء الحساب. بعد الانتهاء من الحساب، انقر على مسار المخطط لتكبير المنطقة المحددة سابقا وعرض الخرز المكتشف كنقاط بيضاء.
استخدم حبات مختارة لترسيم منطقة متعددة الأضلاع تتضمن النقاط الصحيحة تحت مخروط النمو. ثم بالضغط على Enter على لوحة المفاتيح، ستتغير النقاط البيضاء داخل المنطقة المضلعة إلى اللون الأحمر. انقر على القوة التقديرية في واجهة المستخدم الرسومية.
ثم إدخال قيم لحجم البكسل ومعامل Young كما هو موضح في المخطوطة. ضع قيمة نسبة Poisson ك 0.3 ونفذ القوة التقديرية لبدء الحساب. سيقوم البرنامج بحفظ نتائج الحساب في ملف تنسيق جدول البيانات.
وأظهرت الصور الفلورية من مخروط نمو الخلايا العصبية تعبير Lifeact عالية تسمح تصور مورفولوجيا مخروط النمو تحت الحجاب الحاجز مفتوحة تماما وضيقة. كانت مستويات تعبير HaloTag-actin منخفضة جدا مع إشارات خافتة. عندما يكون الحجاب الحاجز ضيقا بشكل مناسب ، تتضاءل إشارات الخلفية ويظهر فعل واحد في بقع في مخروط النمو.
الباحثون الذين يحققون بشكل مناسب جميع الخطوات سوف نلاحظ تدفق F-actin الرجعية في مخروط النمو. تم تحديد صلابة هلام البولي أكريلاميد عن طريق حساب عمق المسافة البادئة الناجمة عن وزن الغلاف المجهري. تم استخدام مجهر كونفوجكال ليزر لالتقاط صور لسطح الجل وأسفل الغلاف المجهري.
لم تكن الإشارات من الخرز الفلوري مرئية على سطح الجل في المنطقة البادئة. وأظهرت صور الفلوريس من الخرز جزءا لا يتجزأ من هلام البولي أكريلاميد ومخروط النمو العصبي، والخرز في أصلها والمواقف المشردين. كما لوحظت إشارة EGFP لمخروط النمو.
عرضت الكيموغراف حركات الخرزة مقارنة بالخرز المرجعي. عند إجراء التصوير بقع واحد، أشياء هامة لتحديد الخلايا العصبية التي تعبر أسبوعيا عن كيفية actin تحت اثنين من مساحة الحد الأدنى. عند إجراء المجهر قوة الجر، التصوير التكبير عالية مهم لتركيز دقيق لقوة الجر.
