Анализ связи однокраплевой визуализации и микроскопической силы тяги может анализировать молекулярные механизмы для продвижения конуса роста и навигации. В качестве методик используются коммерчески доступные материалы и стандартные микроскопы. Исследователи могут буквально адаптироваться к методам в своих исследованиях.
Начинают с обработки нейронов тетраметилродамином или лигандом TMR в разведении от одного до 2000 в питательной среде в день in vitro 3. Затем поддерживайте нейроны на уровне 37 градусов цельсия с 5% углекислого газа в течение одного часа. После инкубации промыть лиганд TMR три раза предварительно подогретым PBS.
Удалите PBS перед добавлением 0,5 миллилитра подогретой среды L-15 Лейбовица в нейроны. Поддерживайте нейроны на уровне 37 градусов Цельсия в течение одного часа. Затем включите эпифлуоресцентный микроскоп и установите состояние верхнего инкубатора на 37 градусов по Цельсию.
Затем поместите обработанные лигандом TMR нейроны в стеклянную нижнюю чашку на разогретом верхнем инкубаторе. Установите параметры получения изображения, такие как время экспозиции в 500 миллисекунд для флуоресцентных каналов Lifeact и HaloTag-actin и биннинг как 0,065 мкм на 0,065 мкм на пиксель с интервалом времени в три секунды для 50 кадров. После выбора ростового конуса, который сильно выражает Lifeact и еженедельно выражает HaloTag-актин.
Закройте поле на диафрагме, чтобы осветить минимальную область, включающую конус роста, и получить покадровые изображения. В день in vitro 3 замените культуральную среду 0,5 миллилитрами нагретой среды L-15 Лейбовица и поддерживайте нейроны в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия. Для тракционной силовой микроскопии включите лазерный сканирующий конфокальный микроскоп и установите верхний инкубатор на 37 градусов цельсия.
Поместите нейроны на стеклянную нижнюю тарелку на заранее предупрежденном верхнем инкубаторе. Задайте параметры получения изображения, как описано в сценарии меню, и выберите конус роста, который сильно выражает усиленный зеленый флуоресцентный белок или EGFP. Сосредоточьтесь на поверхности геля и получайте покадровые изображения.
Когда это будет сделано, используйте программное обеспечение для обработки изображений для создания одноканальных стеков изображений RGB. Затем сохраните изображения в виде файлов tiff. Затем нанесите 100 микролитров массой 10% по объему додецилсульфата натрия или SDS, растворенного в дистиллированной воде, на стеклянную нижнюю посуду, чтобы расслабить гель-субстрат, высвобождая нейроны из субстрата.
Затем высиживают блюдо в верхнем инкубаторе в течение пяти минут при температуре 37 градусов Цельсия для стабилизации температуры. В лазерном сканирующем конфокальном микроскопе сосредоточьтесь на поверхности геля, чтобы получить изображение бусин в ненатянутой подложке. Создайте одноканальное RGB-изображение бусин в неустановленной подложке и сохраните это изображение в виде файла tiff.
Скачайте код анализа тягового усилия TFM2021 и откройте TFM2021 в MATLAB. Открыть главную. m в TFM2021 и запустите его.
Когда на экране появляется графический интерфейс пользователя. Нажмите на загрузить необученное, изображение подложки и выберите X-Y положение исправленного изображения бусины в ненапряженной подложке. Перейдите к загрузке флуоресцентных изображений бусин и выберите покадровый стек бусин изображений.
Затем нажмите «Загрузить изображения яркого поля», чтобы выбрать покадровое стековое изображение яркого поля, и используйте загрузку изображений GFP для выбора изображения стека EGFP. В раскрывающемся списке графического интерфейса пользователя выберите GFP перед нажатием на ROI, чтобы указать интересующую область прямоугольника, включая конус роста, щелкнув две точки на отображаемом изображении ячейки. После этого нажмите кнопку сохранения в графическом интерфейсе пользователя, чтобы сохранить выбранные изображения стека вместе с ROI в матовом файле.
Затем нажмите на spot detect и введите желаемое значение в диалоговом окне, чтобы определить пороговое значение для обнаружения бусин. Нажмите «Хорошо», чтобы начать расчет. После завершения расчета нажмите на дорожку графика, чтобы увеличить область, выбранную ранее, и отобразить обнаруженные бусины в виде белых точек.
Используйте выделенные бусины для разграничения полигональной области, которая включает правильные точки под конусом роста. Затем, нажав клавишу ВВОД на клавиатуре, белые точки в полигональной области превратятся в красный. Нажмите на оценку силы в графическом интерфейсе пользователя.
Затем введите значения для размера пикселя и модуля Юнга, как описано в рукописи. Поставьте значение коэффициента Пуассона равным 0,3 и выполните оценочную силу, чтобы начать расчет. Программа сохранит результаты расчета в файл формата электронной таблицы.
Флуоресцентные изображения конуса роста нейронов показали высокую экспрессию Lifeact, позволяющую визуализировать морфологию конуса роста под полностью открытой и узкой диафрагмой. Уровни экспрессии HaloTag-актина были очень низкими с тусклыми сигналами. Когда диафрагма соответствующим образом сужается, фоновые сигналы уменьшаются, и в конусе роста появляется одиночный акт в крапинках.
Исследователи, которые надлежащим образом достигнут всех шагов, будут наблюдать ретроградный поток F-актина в конусе роста. Жесткость полиакриламидного геля определяли путем расчета глубины углубления, вызванного весом микросферы. Лазерный сканирующий конфокальный микроскоп использовался для захвата изображений поверхности геля и дна микросферы.
Сигналы от флуоресцентных шариков не были видны на поверхности геля в области с отступом. Флуоресцентные изображения бусин, встроенных в полиакриламидный гель и нервный конус роста, показали бусины в их происхождении и смещенных положениях. Также наблюдался сигнал EGFP конуса роста.
Кимографы отображали движения бусины по сравнению с эталонной бусиной. При выполнении одной спекл-визуализации важно выбрать нейрон, который еженедельно выражает, как действовать под двумя минимальными площадями. При выполнении микроскопии силы тяги важна визуализация с высоким увеличением для точной концентрации силы тяги.
