لذا فإن مختبري مهتم بفهم كيفية نمو العين والدماغ معا. تسمح لنا هذه التقنية بدراسة كيفية تأثير مدخلات الشبكية على نمو الدماغ وتطوره. يسمح لنا الاستئصال الجراحي لعين واحدة من الزرد اليرقي الحي ، متبوعا بمراقبة التكتوم البصري بمقارنة الفصوص التكتالية المعصبة والمشوهة داخل نفس الحيوان وعبر الحيوانات.
إن الجمع بين هذه التقنية والأساليب الجزيئية الحديثة يمكن أن يعطي نظرة جديدة على الآليات الكامنة وراء التطور العصبي والتجديد والانحطاط. للبدء ، قم بتوصيل أسلاك الكاثود والأنود بمصدر الطاقة. قم بتوصيل مشبك التمساح في نهاية سلك الكاثود بمشبك ورق مستقيم جزئيا وأدخل مشبك الورق في محلول هيدروكسيد البوتاسيوم ، مع إرفاقه بجانب الجرة.
نعلق مشبك التمساح من سلك الأنود على عنق حامل الإبرة. حول الطاقة إلى حوالي 20 فولت واغمس سلك التنغستن في محلول هيدروكسيد البوتاسيوم ، واسحب السلك من المحلول بزاوية لشحذ السلك كهربائيا إلى طرف دقيق. تحقق من طرف الإبرة تحت المجهر التشريحي للتأكد من أنها حادة بما فيه الكفاية.
ينتج طرف إبرة المنحنى عندما يتم ثني الإبرة الحادة عن طريق لمسها بلطف إلى طبق Petri. في يوم الجراحة ، استخدم ماصة مراعي زجاجية واسعة التجويف لنقل 10 إلى 15 يرقات إلى طبق بتري 35 ملم مملوء ب E3 الطازج. أضف ثلاث إلى خمس قطرات من المخدر إلى اليرقات. لتحديد ما إذا كانت اليرقات مخدرة بشكل كاف ، ابحث عن نقص استجابة اللمس.
أضف قطرتين إلى ثلاث قطرات أخرى من المخدر إذا كانت اليرقات لا تزال تستجيب للمس بعد ثلاث دقائق وتعيد تقييمها. لشل حركة اليرقة للجراحة ، خذ يرقة واحدة إلى ماصة مراعي زجاجية ضيقة التجويف مع كمية صغيرة فقط من E3. بعد ذلك ، تناول ما يقرب من 200 ميكرولتر من نقطة الانصهار المنخفضة بنسبة 1٪ أو أغاروز LMP في الماصة التي تحتوي على اليرقة واخلطها لضمان تعليق اليرقة في أغاروز LMP. ضع غطاء طبق بتري 35 ملم مواجها تحت المجهر التشريحي ، ثم رش اليرقة والأغاروز على غطاء طبق بتري رأسا على عقب.
انشر الأغاروز بحيث تكون اليرقة في وسط القطرة. باستخدام إبرة التنغستن الباهتة ، قم بمناورة اليرقة بسرعة ولكن بلطف بحيث تكون جانبية مع توجيه عين واحدة لأعلى. انتظر عدة دقائق حتى يتم تعيين الأغاروز.
بعد حافة مدار العين ، استخدم طرف إبرة التنغستن الدقيقة التي تم شحذها كهربائيا لاختراق الجلد حول العين. ثم حرك حافة الإبرة تحت العين من الجانب الصدغي البطني للعين. استخدم الضغط المتحكم فيه لتحرير العين من المقبس.
استمر في الضغط على العين ظهريا وأماميا مع جانب الإبرة ، وفي النهاية قم بتقطيع العصب البصري وإطلاق العين. بدلا من ذلك ، يمكنك استخدام ملقط جراحي دقيق جدا لإزالة العين عن طريق قرص العصب البصري ودفع العين من الإنسي إلى الجانبي. بعد إزالة العين بنجاح ، قم بتغطية الأغاروز بمحلول MMR ، وحرر كل يرقة من الأغاروز عن طريق تنظيف إبرة التنغستن بلطف حول رأسها ثم حول جسمها ، مع تثبيت غطاء طبق بتري بالملقط.
بعد العمليات الجراحية ، ضع اليرقة في محلول MMR المكمل بالمضادات الحيوية حتى اليوم التالي ، ثم أعد اليرقة إلى E3 وقم بإعادتها حتى نقطة نهاية التجربة. بعد تخدير اليرقة نهائيا ، قم بإصلاحها بنسبة 4٪ paraformaldehyde. اليرقات الثابتة في قطرات PBS على لوحة واقية من الختم تحت مجهر تشريح.
قم بتأمينها أفقيا عن طريق وضع اثنين من دبابيس التنغستن من خلال notochord مع دبوس واحد خلفي إلى المنطقة المصطبغة التي تغطي منطقة AGM وآخر يتماشى مع نهاية امتداد صفار البيض. قم بإزالة العين بإبرة التنغستن الحادة والملقط الدقيق. في بعض الأحيان يكون من الممكن كز الإبرة من خلال الفك إلى الجانب الآخر وإزالة العين الأخرى.
استخدم إبرة التنغستن للخدش من الجانب الصدغي إلى الجانب البطني من الأذن. في نفس الإجراء أثناء الحركة ، أحضر الإبرة الخلفية إلى الفك واسحبها بلطف إلى الأمام حتى تتم إزالة الأذن والفك. قم بإزالة العين والأذن الأخرى عن طريق دس الإبرة عبر الفك.
استخدم الملقط لسحب الأعضاء البطنية وصفار البيض المتبقي. أخيرا ، قم بعمل شق ضحل في جلد الجمجمة الظهرية بالقرب من التقاطع بين الدماغ الخلفي والحبل الشوكي. ارفع الجلد باستخدام الملقط واسحبه أماميا وحول الدماغ الدماغي.
إزالة أي الأنسجة المتبقية مع ملقط. قم بفك اليرقة ونقلها إلى PBS إلى أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 ملليلتر. قم بتأمين شريحة حجرية في غطاء طبق بتري 100 ملم مع شحوم فراغية.
انقل اليرقة الملطخة بالمناعة والمعالجة إلى صفيحة بئر أو شريحة اكتئاب لعرضها باستخدام مجهر تشريح. قم بتركيب اليرقة على الشريحة الحجرية في أعمدة أغاروز LMP بنسبة 1٪. باستخدام كوب بعد الماصة الخاصة بك ، ضع يرقة واحدة على الشريحة الحجرية ، وترسب أقل قدر ممكن من PBS.
قم بتغطية اليرقة بأغاروز LMP المذاب والدافئ بنسبة 1٪ باستخدام نفس الماصة. ماصة LMP agarose في عمود ثم وضع اليرقة بشكل متماثل قدر الإمكان مع السطح الظهري مرئية. بعد إزالة العين ، لوحظ تنكس تدريجي للمحاور العصبية للشبكية في neuropil التكتوم البصري.
وبحلول يومين بعد الجراحة، أظهرت المحاور المحورية المسماة ب RFP علامات مميزة للانحطاط الواليري السريع، مثل التخبط والتشظي. لوحظت بوصلة إيجابية RFP داخل وخارج neuropil على الجانب الأيمن من التكتوم كما هو موضح في الأسهم. وبحلول أربعة أيام بعد الجراحة، انخفضت المحاور المجزأة والحطام المحوري المسمى RFP بشكل كبير في الفص التكتالي الأيمن، مما يشير إلى إزالة سريعة نسبيا للمحاور العصبية المحتضرة والمتدهورة.
تم الكشف عن الدماغ عن طريق تشريح العينين والفك والأذنين وقلنسوة الجلد والأنسجة الضامة. من الناحية المثالية ، يبقى الدماغ سليما أثناء هذا الإجراء. ومع ذلك ، من المحتمل أن تكون أجزاء من الدماغ الأمامي ، وخاصة المصباح الشمي ، قد تضررت أو تمت إزالتها بالكامل عند إزالة غطاء الجمجمة من الجلد أو الفك.
علاوة على ذلك ، في بعض الأحيان يتم تقطيع الحافة الجانبية للتكتوم عند ثقب الجلد أو قرصه لسحبه من الدماغ. لا توجد عينتان متطابقتان. لذلك يجب أن تكون قادرا على إجراء تعديلات دقيقة من خلال إزالة العين وتشريح الدماغ حسب الحاجة.
المرضى والأدوات الحادة ضرورية للنجاح. يمكن متابعة هذه التقنية بنهج خلوية وجزيئية ، مثل تصوير الخلايا الحية في الجسم الحي أو تسلسل الحمض النووي الريبي لاكتساب رؤى جديدة حول الآليات الجزيئية والخلوية لنمو التكتوم البصري وتطوره.
