Então meu laboratório está interessado em entender como o olho e o cérebro crescem juntos. Essa técnica nos permite estudar como a entrada da retina influencia o crescimento e o desenvolvimento do cérebro. A remoção cirúrgica de um olho do zebrafish larval vivo, seguida da observação do tectum óptico, permite comparar lobos tectal inervados e denervados dentro do mesmo animal e em animais.
Combinar essa técnica com abordagens moleculares modernas pode dar uma nova visão sobre mecanismos subjacentes ao desenvolvimento neural, regeneração e degeneração. Para começar, conecte os fios de cátodo e ânodo à fonte de alimentação. Conecte o clipe de jacaré na extremidade do fio do cátodo a um clipe de papel parcialmente endireitado e insira o clipe de papel na solução de hidróxido de potássio, prendendo-o ao lado do frasco.
Coloque o clipe do jacaré do fio ânodo no pescoço do suporte da agulha. Gire a energia para aproximadamente 20 volts e mergulhe o fio de tungstênio na solução de hidróxido de potássio, puxando o fio para fora da solução em um ângulo para afiar eleticamente o fio em uma ponta fina. Verifique a ponta da agulha sob o microscópio de dissecação para garantir que ela esteja afiada o suficiente.
A ponta da agulha curva resulta quando a agulha afiada é dobrada tocando-a suavemente na placa de Petri. No dia da cirurgia, use uma pipeta de pastagem de vidro de furo largo para transferir de 10 a 15 larvas para uma placa de Petri de 35 milímetros cheia de E3 fresca. Adicione três a cinco gotas de anestésico à larva. Para determinar se as larvas estão adequadamente anestesiadas, procure a falta de resposta ao toque.
Adicione mais duas a três gotas do anestésico se as larvas ainda responderem ao toque após três minutos e reavaliar. Para imobilizar a larva para cirurgia, leve uma larva para cima em uma pipeta de pastagem de vidro com apenas uma pequena quantidade de E3. Em seguida, pegue aproximadamente 200 microliters de ponto de fusão derretido 1% baixo ou LMP agarose na pipeta contendo a larva e misture para garantir que a larva seja suspensa na agarose LMP. Coloque a tampa de uma placa de Petri de 35 milímetros virada sob o microscópio dissecando, em seguida, esguiche a larva e a agarose sobre a tampa da placa de Petri de cabeça para baixo.
Espalhe a agarose para que a larva esteja no centro da queda. Usando uma agulha de tungstênio maçante, manobrar rapidamente, mas suavemente, a larva para que fique lateral com um olho voltado para cima. Espere vários minutos para a agarose definir.
Seguindo a borda da órbita dos olhos, use a ponta de uma fina agulha de tungstênio eleticamente afiada para perfurar a pele ao redor do olho. Em seguida, deslize a borda da agulha sob o olho do lado temporal-ventral do olho. Use pressão controlada para soltar o olho da tomada.
Continue pressionando o olho dorsalmente e anteriormente com o lado da agulha, eventualmente cortando através do nervo óptico e liberando o olho. Alternativamente, você pode usar fórceps cirúrgicos muito finos para remover o olho, beliscando o nervo óptico e empurrando o olho de medial para lateral. Após uma remoção bem sucedida do olho, cubra a agarose com solução MMR, liberte cada larva da agarose escovando suavemente uma agulha de tungstênio em torno de sua cabeça e, em seguida, em torno de seu corpo, enquanto estabiliza a tampa da placa de Petri com fórceps.
Após as cirurgias, coloque a larva na solução mmr complementada com antibióticos até o dia seguinte, depois devolva a larva para a E3 e elare as até o ponto final do experimento. Depois que a larva for anestesiada terminalmente, fixe-as com 4% de paraformaldeído. Suspenda as larvas fixas em gotículas PBS em uma placa de vedação sob um microscópio dissecando.
Fixe-os lateralmente colocando dois pinos de tungstênio através do notochord com um pino posterior à área pigmentada cobrindo a região AGM e outro em linha com a extremidade da extensão da gema. Remova o olho com uma agulha de tungstênio afiada e fórceps finos. Às vezes é possível cutucar a agulha através da mandíbula para o lado oposto e remover o outro olho.
Use a agulha de tungstênio para coçar do temporal para o lado ventral da orelha. Na mesma ação em movimento, leve a agulha posterior à mandíbula e puxe suavemente anteriormente até que a orelha e a mandíbula sejam removidas. Remova o outro olho e orelha cutucando a agulha através da mandíbula.
Use fórceps para retirar os órgãos ventrais e a gema restante. Finalmente, faça uma incisão rasa na pele craniana dorsal perto da junção entre o cérebro traseiro e a medula espinhal. Levante a pele com os fórceps e puxe-a anteriormente e ao redor do telencephalon.
Remova qualquer tecido restante com fórceps. Despreeça a larva e transfira para PBS em tubo de microcentrífugo de 1,5 mililitro. Fixar um deslizamento de câmara na tampa de uma placa de Petri de 100 milímetros com graxa de vácuo.
Transfira a larva imunossu detida e processada para uma placa de poço ou deslizamento de depressão para vê-las com um microscópio dissecando. Monte a larva no escorregador de câmara em colunas de agarose de 1%LMP. Usando um copo além da pipeta, coloque uma larva no escorregador de câmara, depositando o mínimo de PBS possível.
Cubra a larva com agarose derretida e quente de 1%LMP usando a mesma pipeta. Pipeta o LMP surgiu em uma coluna e, em seguida, posicionar a larva tão simetricamente quanto possível com a superfície dorsal visível. Após a remoção dos olhos, observou-se degeneração progressiva dos axônios de retina no neuropil tectum óptico.
Em dois dias após a cirurgia, os axônios rotulados pela RFP exibiram marcas de rápida degeneração walleriana, como blabbing e fragmentação. Os punctas positivos rfp foram notados dentro e fora do neuropil no lado direito do tectum, conforme indicado pelas setas. Em quatro dias após a cirurgia, axônios fragmentados e detritos axonais rotulados por RFP foram consideravelmente reduzidos no lobo tectal direito, indicando uma liberação relativamente rápida dos axônios moribundos e degenerados.
O cérebro foi exposto dissecando os olhos, mandíbula, orelhas e crânio da pele e tecidos conjuntivos. Idealmente, o cérebro permanece intacto durante este procedimento. No entanto, partes do cérebro da frente, particularmente a lâmpada olfativa, foram provavelmente danificadas ou completamente removidas quando a tampa do crânio da pele ou mandíbula foi removida.
Além disso, às vezes a borda lateral do tectum é cortada ao perfurar ou beliscar a pele para retirá-la do cérebro. Nenhuma amostra é idêntica. Então você precisa ser capaz de fazer adaptações sutis através da remoção dos olhos e dissecção cerebral conforme necessário.
Pacientes e ferramentas afiadas são essenciais para o sucesso. Essa técnica pode ser acompanhada de abordagens celulares e moleculares, como a imagem de células vivas in vivo ou sequenciamento de RNA para obter novas percepções sobre os mecanismos moleculares e celulares do crescimento e desenvolvimento do tectum óptico.
