يسمح هذا البروتوكول بالزراعة في المختبر والتصور المجهري المباشر لأنسجة مجرى الهواء المعزولة أثناء إجراءات معالجة الأنسجة المختلفة ، مثل إزالة الظهارة وتجديد أنسجة مجرى الهواء. يسمح التصوير في الموقع المقترح في هذه الدراسة بالمراقبة السريعة وغير المدمرة لتجويف القصبة الهوائية أثناء الإزالة الخاضعة للرقابة الموجهة بالتصوير للظهارة الداخلية وتوصيل الخلايا الخارجية. يمكن استخدام منصة التفاعل الحيوي الموجهة بالتصوير وبروتوكولات معالجة الأنسجة لتوليد أنسجة مجرى الهواء المهندسة بيولوجيا لنمذجة الأمراض وفحص الأدوية.
سيتم عرض بناء واستخدام المفاعل الحيوي لأنسجة مجرى الهواء المدعوم بالتصوير من قبل اثنين من طلاب الدكتوراه من مجموعتنا البحثية ، محمد مير ، وجياوين تشن. لبدء إنشاء جهاز تصوير في الموقع، أدخل عدسة أنبوبية في أنبوب عدسة قابل للتكديس وقم بتأمينه باستخدام حلقة استبقاء. بعد ذلك، قم بتركيب مجموعة طاولة العدسة على كاميرا CMOS علمية عبر محول C-mount.
استخدم برنامج Micromanager لتشغيل الكاميرا والحصول على الصور ومقاطع الفيديو. أثناء استهداف كائن يقع على بعد 10 أمتار من الكاميرا ، اضبط المسافة بين عدسة الأنبوب ومستشعر التصوير الخاص بالكاميرا حتى يتم تشكيل صورة مركزة للكائن على شاشة الكمبيوتر. بعد ذلك ، استخدم مكونات نظام القفص البصري ، مثل قضيب التجميع ولوحة القفص الملولبة ومكعب القفص لتركيب عدسة مرشح على مرآة ثنائية اللون ذات حواف مزدوجة وفائقة الدقة وليزر على الجهاز.
قم بتوصيل عدسة موضوعية مقاس 20 ضعفا بالجهاز. بعد ذلك، قم بتركيب عدسة خضراء يبلغ قطرها 500 ميكرومتر في الطرف البعيد من أنبوب العدسة عبر مترجم X-Y. اضبط المسافة بين العدسات الخضراء والعدسات الموضوعية لتشكيل الصور المجهرية المركزة.
لتصور تجويف القصبة الهوائية للفئران المعزولة في المجال الساطع أو الفلورسنت ، ضع المفاعل الحيوي على مرحلة التصوير. بعد ذلك ، قم بغرس 500 ميكرولتر من استر الكربوكسي فلوريسين سوكسينيميديل المحضر حديثا ، أو محلول CFSE ، بمعدل تدفق قدره خمسة ملليلتر في الدقيقة عبر القصبة الهوائية عبر مضخة المحقنة المتصلة بأنابيب قنية القصبة الهوائية. بمجرد أن يملأ محلول CFSE القصبة الهوائية ، أوقف المضخة.
بعد 10 دقائق ، اغسل تجويف القصبة الهوائية عن طريق غرس 10 ملليلتر من PBS باستخدام مضخة المحقنة لإزالة كواشف CFSE المتبقية غير المدمجة. بعد الغسيل، أدخل نهاية التصوير البعيدة للعدسة الخضراء في القصبة الهوائية عبر موصل luer المتصل بأحد طرفي القصبة الهوائية. ثم حرك العدسة الخضراء برفق داخل القصبة الهوائية حتى يتم تركيز سطح القصبة الهوائية.
لالتقاط صور المجال الساطع في برنامج micromanager ، قم بإضاءة تجويف القصبة الهوائية بضوء أبيض من خلال مكعب القفص. ثم انقر فوق الرمز Live لإظهار سطح Lumenal للقصبة الهوائية في الوقت الفعلي. استخدم علامتي التبويب إعداد التصوير والتعريض الضوئي لتغيير وقت التعرض إلى القيمة المطلوبة.
لضبط تباين الصور وسطوعها، استخدم نافذة قياس الرسم البياني والكثافة لنقل الأسهم بالأبيض والأسود في نقطة نهاية شاشة الرسم البياني التفاعلي. انقر على إيقاف البث المباشر لتنشيط أيقونة Snap ، ثم انقر فوق رمز Snap لتجميد الصورة. بعد ذلك ، استخدم الإعداد تصدير ثم الصور كعلامات تبويب نازحة لحفظ الصور بالتنسيق المطلوب.
للحصول على الصور ومقاطع الفيديو في وضع الفلورسنت ، قم بإضاءة تجويف القصبة الهوائية بضوء ليزر خاص ب CFSE من خلال مكعب القفص واحصل على الصور في الوقت الفعلي عن طريق تحريك مسبار التصوير ذهابا وإيابا. بمجرد الحصول على الصور ومقاطع الفيديو ، قم بإزالة العدسة الخضراء بلطف من القصبة الهوائية. لإزالة الظهارة من القصبة الهوائية ، غرس 50 ميكرولتر من كبريتات دوديسيل الصوديوم الطازجة 2٪ من خلال قنية القصبة الهوائية لتوليد طبقة رقيقة من محلول المنظفات على تجويف القصبة الهوائية.
بعد التقطير ، أغلق وصلات أنابيب المفاعل الحيوي باستخدام سدادات luer من الذكور أو الإناث ونقل المفاعل الحيوي إلى حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق للسماح ل SDS بالسكن داخل القصبة الهوائية. كرر التقطير مرة واحدة. بعد التقطير الثاني ، قم بإزالة الظهارة المحللة و SDS عن طريق ري تجويف القصبة الهوائية ثلاث مرات مع 500 ميكرولتر من PBS عبر مضخة حقنة بمعدل تدفق 10 ملليلتر في الدقيقة.
ثم ضع المفاعل الحيوي على شاكر ليهتز ميكانيكيا بتردد 20 هرتز وسعة إزاحة تبلغ 0.3 ملم لتعزيز انفصال الخلايا الظهارية المعالجة ب SDS جسديا عن تجويف القصبة الهوائية. في حين أن القصبة الهوائية تهتز ميكانيكيا ، قم بغرس 500 ميكرولتر من PBS مرتين من خلال تجويف القصبة الهوائية لإزالة SDS المتبقي وحطام الخلايا. بعد إزالة الظهارة ، قم بتقييم إزالة الطبقة الظهارية عن طريق قياس شدة CFSE باستخدام جهاز تصوير العدسة الخضراء.
بعد تحضير القصبة الهوائية للفئران غير الظهارية ، قم بإذابة الخلايا الجذعية الوسيطة المجمدة ، أو MSCs ، لمدة 30 ثانية في حمام مائي 37 درجة مئوية. ثم ، عد الخلايا باستخدام مقياس الدم ، يليه إعداد محلول خلوي بتركيز خمسة في 10 إلى ست خلايا لكل ملليلتر. ثم ، قم بتسمية الخلايا بشكل فلوري عن طريق احتضانها بملليلترين من محلول CFSE 100 ميكرومولار في درجة حرارة الغرفة.
بعد 15 دقيقة ، اشطف الخلايا بخمسة ملليلتر من PBS ثلاث مرات قبل تعليقها في وسط ثقافة DMEM طازج بتركيز نهائي يبلغ ثلاثة أضعاف 10 إلى سبع خلايا لكل ملليلتر. مباشرة بعد تحضير الكولاجين I هيدروجيل ، كما هو موضح في المخطوطة ، أضف الخلايا إلى محلول الهيدروجيل بالتركيز المطلوب. ثم ، امزج الخلايا ومحلول الجل مع ماصة دقيقة للحصول على خليط موحد من الهلام الخلوي المائي.
بعد ذلك ، قم بتوصيل أحد طرفي القصبة الهوائية داخل المفاعل الحيوي بمضخة حقنة قابلة للبرمجة من خلال موصل luer وتوصيل خمسة ملليلترات من وسط الاستزراع الطازج إلى غرفة المفاعل الحيوي عند 37 درجة مئوية لتغطية السطح الخارجي للقصبة الهوائية. بعد ذلك ، قم بإعطاء 10 ميكرولترات من خليط الخلية والهيدروجيل في القصبة الهوائية غير الظهارية داخل المفاعل الحيوي لتوليد طبقة هيدروجيل خلوية على تجويف القصبة الهوائية. بعد حقن الخلايا، ضع المفاعل الحيوي في حاضنة زراعة الخلايا المعقمة عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون للتبلور لمدة 30 دقيقة للسماح بالتبلور.
لتصور توزيع الخلايا المزروعة ، قم بتعقيم العدسة الخضراء بكحول الأيزوبروبيل أو الإيثانول بنسبة 70٪ ووضع المفاعل الحيوي على مرحلة التصوير للحصول على الصور ومقاطع الفيديو في كل من أوضاع المجال الساطع والفلورسنت. بعد 30 دقيقة من بذر الخلايا ، قم بغرس ملليلتر واحد من وسط الثقافة في تجويف القصبة الهوائية بمعدل تدفق ملليلتر واحد في الدقيقة. وأخيرا، استزرع القصبة الهوائية المزروعة بالخلية داخل المفاعل الحيوي في حاضنة عند 37 درجة مئوية للوقت المطلوب.
أثناء زراعة الخلية، حافظ على الوسائط داخل التجويف ثابتة، في حين أن الوسائط خارج القصبة الهوائية يتم تشغيلها باستمرار عبر تدفق أحادي الاتجاه. في صور المجال الساطع والفلورسنت للقصبة الهوائية غير الظهارية ، لم تلاحظ أي إشارة فلورية قبل وضع علامة CFSE. مع CFSE ، لوحظت إشارة فلورسنت موحدة في جميع أنحاء الظهارة.
بعد إزالة الظهارة ، انخفضت كثافة الفلورسنت بشكل كبير ، مما يشير إلى استئصال الظهارة. ويوضح تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين للقصبة الهوائية غير الظهارية إزالة الظهارة الطبقية الزائفة من تجويف القصبة الهوائية، والحفاظ على الخلايا والمصفوفة خارج الخلية، أو الهياكل الدقيقة ECM، في طبقات الأنسجة الأساسية. علاوة على ذلك ، أكد تلطيخ الخماسي والثلاثي الكروم الحفاظ على بنية أنسجة القصبة الهوائية ومكونات ECM ، مثل الكولاجين والبروتين.
التألق المناعي للخلايا الظهارية والكولاجين الأول كشف عن إزالة كاملة للظهارة والحفاظ على الكولاجين I داخل الأنسجة دون الظاهرية. أشارت الصور المجهرية الإلكترونية الماسحة إلى أن القصبة الهوائية الأصلية كانت مأهولة بخلايا متعددة الرؤوس والكأس. في القصبة الهوائية غير الظهارية ، تعرض الغشاء السفلي ، كما هو موضح في شبكة شبكية من ألياف المصفوفة خارج الخلية وغياب الخلايا الظهارية.
تظهر هنا الصور الفلورية للقصبة الهوائية غير الظهارية ، عند البذر باستخدام PBS والكولاجين. بالمقارنة مع الخلايا التي تم زرعها عبر وسط الاستزراع ، ظلت الخلايا ذات العلامات الفلورية التي يتم تسليمها عبر الهيدروجيل ملتصقة بشكل أكثر اتساقا عبر التجويف. أظهرت دراسة جدوى الخلايا أن قابلية البقاء لم تتأثر بإجراء توصيل الخلايا، وظل أكثر من 90٪ من الخلايا قابلة للحياة.
يعد إنشاء طبقة رقيقة من المنظفات في عملية إزالة الظهارة واستخدام الهيدروجيل كوسيلة توصيل للخلايا خطوات أساسية لنجاح هذا البروتوكول. هدفنا البحثي التالي هو زرع خلايا مجرى الهواء الأولية أو الجذعية المزروعة في المختبر على أنسجة مجرى الهواء غير الظهارية للتحقق مما إذا كان يمكن إعداد أنسجة مجرى الهواء الوظيفية.
