ويدعم هذا البحث من قبل برنامج مكافحة والمعاهد الوطنية للصحة (NIH)، مكتب المدير، والمعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية (معهد علوم الصحة البيئية) غرانت عدد U54 ES015678 (CWW). ويدعم أيضا SA مستشفى الأطفال مدرسة كولورادو / كولورادو للمناجم التعاون جائزة الطيار # G0100394 ومستشفى الأطفال في جائزة البحوث التجريبية كولورادو المعهد # G0100471.

1. الثقافات الجرذ Cardiomyocyte <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجريت جميع التجارب في إطار البروتوكولات التي وافقت عليها لجنة رعاية الحيوان واستخدام المؤسسية، IACUC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول العضلية الفئران من قلوب (البطينين) من ذكور الفئران (240-260 ز) باستخدام الأساليب المذكورة سابقا 4. لفترة وجيزة، تخدير الحيوانات باستخدام حقنة داخل الصفاق من بنتوباربيتال (100 ملغ / كغ؛ تأكيد التخدير عن طريق قرصة أخمص القدمين طريقة) ثم قم بإزالة القلوب إلى 10.0 مل، 1 ملم كا 2 + التي تحتوي على كريبس قارع الأجراس العازلة، ودرجة الحموضة 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف قلوب 5-6X لإزالة الدم ومن ثم التبديل إلى كا 2 + خالية العازلة كريبس قارع الأجراس التي تحتوي على 0.02٪ و 0.06٪ البروتيني كولاجيناز A (5.0 مل / القلب). احتضان القلوب في هذا الحل لمدة 10-15 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع الهز في بعض الأحيان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 10-15 دقيقة، تغسل الحل الأنزيمية مع كا 2 + خالية العازلة كريبس قارع الأجراس لمدة 5 دقائق إضافية. الافراج عن الخلايا من الأنسجة مترهلة بناجي ماصة 25 مل من قبل pipetting تعليق صعودا وهبوطا عدة مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل الخلايا من الأنسجة من خلال تصفية 70 ميكرومتر من خلال شبكة من النايلون والسماح لهم بالاستيطان في كريبس قارع الأجراس العازلة التي تحتوي على 0.1 ملي كا 2 +. تعليق بيليه خلية في 1.0 مل كريبس قارع الأجراس العازلة التي تحتوي على 0.2 ملي كا 2 +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طبقة بعناية على 5.0 مل من 60 ميكروغرام / مل ألبومين المصل البقري، BSA، في 15 مل أنابيب الطرد المركزي، لفصل العضلية من nonmyocytes والسماح لهم لتسوية لمدة 30 دقيقة. والعضلية هي أثقل والانتقال إلى الجزء السفلي من الأنبوب. إزالة بعناية الخلايا طاف وسائل الإعلام. كرر هذه الخطوة مرة واحدة لمزيد من تنقية الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الانتقال تدريجيا عن طريق الغسيل (في الخطوات باستخدام 0.25 ملي، 0.5 ملي، 0.75 ملم، و 1.0 ملي كا 2 + التي تحتوي على المخزن المؤقت) على myocytes البطين / العضلية إلى 1.0 ملي كا 2 + التي تحتوي على العازلة ومعلق في الإنجاز والإبداع المتوسطة التي تتكون من Dulbecco لتعديل النسر متوسطة ، DMEM containiنانوغرام 2 ملغ / مل BSA، 2 مم L-الكارنيتين، 5 ملي الكرياتين، 5 ملي التورين، و 100 وحدة دولية / مل البنسلين، و 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة والعضلية في الإنجاز والإبداع في مناطق ذات كثافة متوسطة من 100 إلى 150 خلية / ملم 2 على 100 ​​مم أو 35 مم laminin المغلفة الأطباق ثقافة البلاستيك أو 40 × 22 مم coverslips الزجاج precoated مع laminin (1 ميكروغرام / سم 2). بعد 1 ساعة، وغسل الأطباق مع 2.0 مل الإنجاز والإبداع لإزالة الخلايا التي لا تعلق. إضافة 10.0 مل من وسائل الإعلام الجديدة واحتضان الخلايا. </li></ol> 2. المتباينة واجهة الهواء السائل (علي) ثقافة الخلايا الظهارية البشرية مجرى الهواء بصل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شراء الأنسجة الرغامية القصبية الإنسان من الأمراض القومي للبحوث في إطار تبادل وافق مجلس المراجعة المؤسساتي البروتوكولات. حصاد الخلايا وتؤدي الثقافة باستخدام 5،6 الإجراء المنشورة. يستخدم هذا الإجراء الثقافات الخلية كما هي نموذج دقيق لمخاطر استنشاق الإنسان للالتشنجات اللاإرادية، ومع ذلك، إذا لزم الأمر يمكن للمرء أن عزل وتنمو في ALI مواستخدام و / أو الخلايا الظهارية الهوائية الفئران 7،8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفترة وجيزة، وجعل قطع صغيرة (~ ¼ بوصة) من الأنسجة بعد إزالة جميع الأنسجة والغدد الليمفاوية الضام. غسل الأنسجة عدة مرات في حل أفرز اللبن قارع الأجراس. إضافة إلى أنسجة أنبوب 50 مل المخروطية وإضافة حل البروتيني (1٪ Protease/0.01٪ في الحد الأدنى من وسائل الإعلام الدناز الأساسية، MEM، الأنسجة إلى نسبة السوائل (1:10)). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> موسيقى الروك في الأنسجة عند 4 درجة مئوية لمدة ليلة وضحاها. إنهاء تفكك الأنسجة بإضافة 10٪ مصل بقري جنيني. كشط سطح الظهارية مع مشرط الجراحة وجمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي (2،000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا لوحة في مرور واحد على snapwells المغلفة الكولاجين في المتوسطة الخاصة ALI أعد كما هو موضح بالتفصيل من قبل فوشيه وآخرون 9. الثقافة لمدة 5 أيام قبل تغيير إلى واجهة الهواء السائل (علي) عن طريق إزالة وسائل الإعلام القمي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغذية الخلايا باستخدام وسائل الإعلام ALI كل يوم المناوبين وتسمح للخلايا التفريق لمدة 2-3 أسابيع إضافية (نلاحظ العديد من أهداب الضرب وإفراز المخاط) قبل تنفيذ التعرض. يغسل السطح القمي مع برنامج تلفزيوني الدافئة جنبا إلى جنب مع التغييرات الوسائط. </li></ol> 3. التعرض للكلور <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحتوي على نظام التعرض الكلور (CES) داخل غطاء الكيميائية المؤهلين مع سرعة وجه التشغيلية 100 التيار الوطني الحر الذي يوفر الاحتواء الثانوية اللازمة لمنع التعرض للموظفين في حال تسرب الكلور عرضي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل النظام تحت ضغط إيجابي طفيف (0.5 بوصة من الماء). ويتم تغذية الهواء الجاف في 15 لتر / دقيقة وعلى مستوى مناسب من يتغذى الكلور لبلوغ تركيز الكلور النهائي المطلوب. غرف لديها غطاء تأمين مع 4 أقفال BCU صغيرة ومنخفضة durometer سيليكون طوقا لتوفير ختم الضغط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقديم خليط الكلور من 2 إلى وحدة تحكم كتلة تدفق. يستخدم CES اسطوانة غاز مضغوط يحتوي على 1.0٪ كلور 2 في النيتروجين الجاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيم تدفق الهواء التخفيف باستخداممصممة خصيصا لوحة التحكم وبالمثل تنظيم تركيز الكلورين 2 تسليمها إلى غرف التعرض. وانخفاض حجم مضخة أخذ العينات تسحب العادم من الغرف إلى محلل الكلور لرصد تركيزات التي يتم ثم تسجيلها على مسجل بيانات متصلة محلل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس معدلات التدفق داخل غرف قبل التعرض باستخدام تدفق متر لضمان المساواة في معدلات التسليم والعادم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مزارع الخلايا للتعرض عن طريق إزالة وسائل الإعلام طاف وإضافة وسائل الإعلام الجديدة (الإعلام basolateral في الثقافات ALI). أي المعالجة المسبقة مع وكلاء يمكن أن يؤديها في هذا الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فضح الثقافات ALI من الخلايا الظهارية مجرى الهواء إلى الكلور غاز 2 (50، 100، 300 جزء في المليون أو لمدة 30 دقيقة) في اثنين من مختومة غرف polysulfone الاحتواء البيولوجي. يتعرض العضلية (المغمورة أو متموجة الثقافات على الأغشية) إلى 50 أو 100 جزء في المليون الكلورين 2 لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التعرض تدفق غرف مع الهواء حتى Cيقع مستوى ل 2 أقل من 1 جزء في المليون ويمكن فتح بأمان لإزالة الخلايا (خلال 5 دقائق). </li></ol> 4. المقاومة الكهربائية بطريق الظهارة (TER) قياس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس TER من الهواء السائل واجهة، ALI والثقافات باستخدام voltohmmeter الظهارية مع زوج من كلوريد الفضة الأقطاب &quot;عود&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوازن القطب عود في دقيقة وسائل الإعلام ALI 15 قبل الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة وسائط الحارة للقمي (1.0 مل) وbasolateral (2.0 مل) السطح وقياس TER باستخدام أقطاب عود من voltohmmeter. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراجع الذراع أقصر من القطب في وسائل الإعلام القمي والذراع يعد في وسائل الإعلام basolateral. انقر على زر &#39;التدبير&#39; على voltohmmeter لتقييم المقاومة الكهربائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وvoltohmmeter لديه خيار لقياس أوم أوم أو ك. طرح المقاومة عبر دعم ثقافة خالية من الخلايا من المقاومة تقاس عبر كل طبقة الخلايا لانتاج العابرالمقاومة الظهارية (TER). </li></ol> 5. قياس كاسباس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة وسائط جديدة ALI (2.0 مل) إلى سطح basolateral التعرض آخر واحتضان الخلية في درجة حرارة الغرفة. جمع وسائل الإعلام طاف في 4 و 24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس كاسباس 3/7 النشاط في supernatants وسائل الإعلام باستخدام كاسباس التجارية 3/7 طقم الفحص. </li></ol> 6. وصمة عار الغربية وكيمياء سيتولوجية مناعية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء البقع الغربية باستخدام لست] خلية كما هو موضح سابقا 10. تعليق المحللة البروتين (20 ميكروغرام) في خفض 5X العازلة عينة وتغلى لمدة 5 دقائق. إخضاع المحللة البروتين لSDS-PAGE (4-15٪) ونقل البروتينات فصلها لغشاء النيتروسليلوز بواسطة النشاف الكهربي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منع غير محددة وملزمة من قبل احتضان الغشاء مع الحليب 5٪ في غسل العازلة (PBS + المنظفات 0.1٪) وتحقيق في الأغشية مع الأجسام المضادة الأولية ضد SERCA2 أو الأكتين الساركومير في 1:1،000 التخفيف، وبين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. المقبل، وغسل واحتضان الأغشية مع الأجسام المضادة البيروكسيداز مترافق منها الثانوي وتطوير للكشف كما هو موضح قبل 10 باستخدام التجارية البيروكسيديز كشف عدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكيمياء سيتولوجية مناعية علاج الخلايا الحية نمت على إدراج أو coverslips الزجاج في 6 لوحات جيدة مع 0.4٪ تريتون-X-100 في 10 ملي العازلة سيترات الصوديوم لمدة 20 دقيقة بعد الشطف مع برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كتلة غير محددة ملزمة عن طريق علاج الخلايا مع 5٪ مصل حمار لمدة 20 دقيقة، ثم احتضان الخلايا مع مفتش غير محددة أو الأجسام المضادة الأولية الفردية محددة لالأكتين الساركومير أو كي 67. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني واحتضان مع الأجسام المضادة الثانوية فلوري، مترافق للكشف عن الأجسام المضادة الأولية وصمة عار النووية (1 ميكروغرام / مل دابي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل مع برنامج تلفزيوني وجبل coverslips باستخدام وسائل الإعلام التجارية في تصاعد مستمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصور تلطيخ باستخدام المجهر الفلورسنت. </li></ol>

<ol>
	<li>Mohan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+accidental+exposure+to+chlorine+gas:+clinical+presentation,+pulmonary+functions+and+outcomes.">Acute accidental exposure to chlorine gas: clinical presentation, pulmonary functions and outcomes.</a> Indian J Chest Dis Allied Sci. 52, 149-152 (2010).</li><li>Kose, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+infarction,+acute+ischemic+stroke,+and+hyperglycemia+triggered+by+acute+chlorine+gas+inhalation.">Myocardial infarction, acute ischemic stroke, and hyperglycemia triggered by acute chlorine gas inhalation.</a> Am J Emerg Med. 27, 1021-1024 (2009).</li><li>Das, R., Blanc, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorine+gas+exposure+and+the+lung:+a+review.">Chlorine gas exposure and the lung: a review.</a> Toxicol Ind Health. 9, 439-455 (1993).</li><li>Claycomb, W. C., Palazzo, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+the+terminally+differentiated+adult+cardiac+muscle+cell:+a+light+and+scanning+electron+microscope+study.">Culture of the terminally differentiated adult cardiac muscle cell: a light and scanning electron microscope study.</a> Dev Biol. 80, 466-482 (1980).</li><li>Ahmad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2+suppresses+sarcoplasmic/endoplasmic+reticulum+Ca2+-ATPase+expression+in+cystic+fibrosis+airways:+role+in+oxidant-mediated+cell+death.">Bcl-2 suppresses sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase expression in cystic fibrosis airways: role in oxidant-mediated cell death.</a> Am J Respir Crit Care Med. 179, 816-826 (2009).</li><li>Ahmad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+factor+signals+airway+epithelial+basal+cell+survival+via+coagulation+and+protease-activated+receptor+isoforms+1+and+2.">Tissue factor signals airway epithelial basal cell survival via coagulation and protease-activated receptor isoforms 1 and 2.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 48, 94-104 (2013).</li><li>Lam, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+respiratory+epithelial+cells+and+exposure+to+experimental+cigarette+smoke+at+air+liquid+interface.">Isolation of mouse respiratory epithelial cells and exposure to experimental cigarette smoke at air liquid interface.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li><li>Hosokawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+tracheal+basal+cells+to+ciliated+cells+and+tissue+reconstruction+on+the+synthesized+basement+membrane+substratum+in+vitro.">Differentiation of tracheal basal cells to ciliated cells and tissue reconstruction on the synthesized basement membrane substratum in vitro.</a> Connect Tissue Res. 48, 9-18 (2007).</li><li>Fulcher, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Well-differentiated+human+airway+epithelial+cell+cultures.">Well-differentiated human airway epithelial cell cultures.</a> Methods Mol Med. , 107-183 (2005).</li><li>Ahmad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SERCA2+regulates+non-CF+and+CF+airway+epithelial+cell+response+to+ozone.">SERCA2 regulates non-CF and CF airway epithelial cell response to ozone.</a> PloS One. 6, e10 (2011).</li><li>Martin, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorine-induced+injury+to+the+airways+in+mice.">Chlorine-induced injury to the airways in mice.</a> Am J Respir Crit Care Med. 168, 568-574 (2003).</li><li>Evans, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorine:+state+of+the+art.">Chlorine: state of the art.</a> Lung. 183, 151-167 (2005).</li><li>Vliet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+reactive+nitrogen+species+during+peroxidase-catalyzed+oxidation+of+nitrite.+A+potential+additional+mechanism+of+nitric+oxide-dependent+toxicity.">Formation of reactive nitrogen species during peroxidase-catalyzed oxidation of nitrite. A potential additional mechanism of nitric oxide-dependent toxicity.</a> J Biol Chem. 272, 7617-7625 (1997).</li><li>Ahmad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+epithelial+cells+release+ATP+during+ozone+exposure:+signaling+for+cell+survival.">Lung epithelial cells release ATP during ozone exposure: signaling for cell survival.</a> Free Radic Biol Med. 39, 213-226 (2005).</li><li>Allen, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+system+for+exposure+of+cultured+cells+and+other+materials+to+ozone.">An automated system for exposure of cultured cells and other materials to ozone.</a> Inhal Toxicol. 15, 1039-1052 (2003).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

النوع الاكثر شيوعا من التعرض السامة الحادة يحدث عند واحد يتنفس مادة كيميائية سامة إلى الرئتين. ويمكن أيضا أن تؤخذ هذه المواد الكيميائية بسرعة في مجرى الدم ويمكن أن تؤثر الأجهزة الأخرى مثل الدماغ والقلب. يتم دراسة سمية استنشاق كلاء المختلفة باستخدام نماذج حيوانية وع?...

التعرض للمواد الكيميائية السامة المستنشقة (التشنجات اللاإرادية) / غازات مثل الكلور (الكلورين 2) لا يزال مصدر قلق الصحية الجارية في التعرض العرضي وكذلك في استخدام إمكاناتها كعامل تهديد الكيميائية. على الرغم من أن الرئتين هي الهدف الأساسي، وأجهزة مثل القلب والدماغ التي تتأثر أيضا 1-3. تستخدم في الجسم الحي عموما نماذج لاختبار سمية من التشنجات اللاإرادية، ولكن في فحوصات المختبر لتقييم سمية هي أبسط وأسرع وأكثر فعالية من حيث التكلفة. و تسمح المختبر النماذج أيضا للتحقيق واسعة من التفاعلات خلية العامل الذي قد يكون من الصعب تقييم في الجسم الحي. مثل هذه النظم في المختبر التعرض نادرة وعلاوة على ذلك، في بعض النماذج التقليدية حيث يتم إضافة المواد السامة إلى مستنبت في الخلايا التي يتم المغمورة، خصائص وكلاء يمكن أن تتغير بسبب التفاعلات وملزمة للمكونات في المتوسط. في سيناريوهات مثل هذه الأنظمة ثقافة الخلية مثل واجهة الهواء السائل (ALI) الثقافات من الخلايا الأولية الظهارية البشرية الهوائية، المقترح هنا، التي يمكن أن يتعرض مباشرة إلى وكلاء الغازية يمكن أن تكون واعدة. الخلايا الظهارية المبطنة لمجرى الهواء هي خطوط الدفاع الأول ضد استنشاق المواد الكيميائية السامة. ظهارة الهوائية الإنسان يشكل حاجز مادي بين التجويف والخلايا الكامنة في الرئة ويشارك في استجابة الرئة. وتنتج عددا من السيتوكينات وغيرها من العوامل المؤيدة والمضادة للالتهابات، وكذلك تفرز المخاط السائل سطح / الهوائية (ASL) تغطي الظهارة. واحدة من القيود التقليدية في أنظمة غارقة في الثقافة المختبر هو أيضا أن ASL والمخاط التي تغطي سطح الظهارية تتم إزالة أو المخفف. هذا لا يعكس حالة فسيولوجية من الرئة الخلايا الظهارية التي تتعرض للهواء. وبالتالي، ينبغي مثالية في نظام المختبر لاختبار السمية TIC تكرار هذه العمارة. هناك مصلحة كبيرة في تطوير الفحص السريع مethods التي تتنبأ سمية الجسم الحي. الخلايا الظهارية نمت في ALI تمييز ولها هياكل ووظائف متباينة جيدا مقارنة مع الخلايا المزروعة المغمورة ويخدم نموذجا متفوقة في الشعب الهوائية. في هذه الدراسة، ونحن تصف استخدام الثقافة الهواء السائل واجهة من مجرى الهواء الإنسان (الرغامية القصبية) الخلايا الظهارية لاختبار سمية الغاز السامة المستنشقة ومقارنتها مع ثقافة الخلية المغمور من cardiomyocyte، وبالتالي دراسة هدف هام آخر من السمية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1128">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:487px;">Name</td>
			<td style="width:329px;">Company</td>
			<td style="width:147px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:487px;">Rats</td>
			<td style="width:329px;">Harlan Laboratories</td>
			<td>Sprague-Dawley&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:487px;">Pentobarbital</td>
			<td style="width:329px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">P3761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:487px;">Chlorine</td>
			<td style="width:329px;">AirGas, Inc</td>
			<td style="width:147px;">X02NI99CP163LS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:487px;">Caspase 3/7 kit&#160;</td>
			<td style="width:329px;">Promega</td>
			<td style="width:147px;">G8091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:487px;">Epithelial voltohmmeter and chopstick electrode</td>
			<td style="width:329px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:147px;">EVOM and STX2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:487px;">Snapwell inserts</td>
			<td style="width:329px;">Corning</td>
			<td style="width:147px;">07-200-708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">70 micron nylon cell strainer</td>
			<td style="width:329px;">Corning</td>
			<td style="width:147px;">#352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polysulfone biocontainment chambers&#160;</td>
			<td style="width:329px;">BCU, Allentown Cage Equipment</td>
			<td style="width:147px;">BCU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td style="width:329px;">Life technologies</td>
			<td style="width:147px;">12491-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Sarcomeric actin antibody</td>
			<td style="width:329px;">Abcam Cambridge, MA</td>
			<td style="width:147px;">ab28052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SERCA2 antibody</td>
			<td style="width:329px;">&#160;Affinity Bioreagents, Golden, CO</td>
			<td style="width:147px;">MA3-9191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ki-67 antibody</td>
			<td style="width:329px;">&#160;Dako, Carpinteria, CA</td>
			<td style="width:147px;">M7248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa-488-conjugated secondary antibody</td>
			<td style="width:329px;">&#160;Invitrogen, Grand Island, NY</td>
			<td style="width:147px;">A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">BSA</td>
			<td style="width:329px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Carnitine</td>
			<td style="width:329px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">C0283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Taurine</td>
			<td style="width:329px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">T8691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Creatinine</td>
			<td style="width:329px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">C6257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Krebs Ringer Buffer</td>
			<td style="width:329px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">K4002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Protease</td>
			<td style="width:329px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">P5147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Collagenase</td>
			<td style="width:329px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">C6885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; DNAase</td>
			<td style="width:329px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">DN-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Lactated Ringer solution</td>
			<td style="width:329px;">Abott Laboratories</td>
			<td style="width:147px;">7953</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Donkey serum</td>
			<td style="width:329px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">017-000-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">PBS, phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:329px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">D1408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">4-15% SDS-PAGE gels</td>
			<td style="width:329px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:147px;">456-1083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Nitrocellulose membrane</td>
			<td style="width:329px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:147px;">162-0115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Dergent, Tween&#160;</td>
			<td style="width:329px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Peroxidase detection kit</td>
			<td style="width:329px;">Pierce</td>
			<td align="right" style="width:147px;">3402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">DAPI</td>
			<td style="width:329px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Mounting media, Fluormount G</td>
			<td style="width:329px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:147px;">00-4958-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Sodium citrate</td>
			<td style="width:329px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">71497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Collagen</td>
			<td style="width:329px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">C7521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">MEM</td>
			<td style="width:329px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">M8028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Laminin</td>
			<td style="width:329px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:147px;">354259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:329px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">FBS</td>
			<td style="width:329px;">Gibco</td>
			<td style="width:147px;">200-6140AJ</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro cell culture model for toxic inhaled chemical testing

مزارع الخلايا لا غنى عنها لتطوير ودراسة فعالية العوامل العلاجية، وذلك قبل استخدامها في النماذج الحيوانية. لدينا قدرة فريدة لنموذج خلايا ظهارة الهوائية الإنسان وعضلة القلب متباينة بشكل جيد. هذا يمكن أن يكون أداة لا تقدر بثمن لدراسة الآثار الضارة للمواد الكيميائية السامة المستنشقة، مثل الكلور، التي يمكن أن تتفاعل عادة مع أسطح الخلايا، وشكل مختلف منتجاته على التفاعل مع المياه، والحد من آثارها في الثقافات المغمورة. لدينا نموذج باستخدام متباينة بشكل جيد الثقافات الخلايا الظهارية البشرية الهوائية في واجهة الهواء liqiuid تلتف هذا القيد وكذلك توفر فرصة لتقييم آليات حاسمة من سمية المواد الكيميائية السامة المستنشقة المحتملة. نحن تصف خسارة تعزيز النزاهة الغشاء، وإطلاق سراح كاسباس والموت على استنشاق مادة كيميائية سامة مثل التعرض الكلور. في هذه المقالة، فإننا نقترح أساليب لنمذجة التعرض الكلور في قلب الثدييات والهوائية الظهارية جأذرع في الثقافة واختبارات بسيطة لتقييم تأثيرها على أنواع الخلايا هذه.

قضيب على شكل العضلية الأولية نعلق على المصفوفات laminin وانتشر وتفرق في الثقافات متموجة (1A الشكل وأقحم فيها). وتميزت هذه الخلايا مزيد على أساس الأكتين الساركومير وSERCA2 التعبير (الأرقام 1B و 1C). العضلية الفئران هي عرضة للسمية الكلور إلى 15 دقيقة من...

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing at JoVE.com

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

تم تصميم هذا البروتوكول لإظهار طريقة التعرض للثقافات الخلية لاستنشاق المواد الكيميائية السامة. تعرض متباينة واجهة الهواء السائل (علي) الثقافات من الخلايا الظهارية الهوائية يوفر نموذجا فريدا للتعرض الشعب الهوائية للغازات السامة مثل الكلور. في هذا المخطوط وصفنا تأثير استنشاق الكلور على الثقافات واجهة الهواء السائل من الخلايا الظهارية والثقافة المغمور من العضلية. في المختبر أنظمة التعرض تسمح الآلية الدراسات الهامة لتقييم المسارات التي يمكن عندئذ أن تستخدم لتطوير العوامل العلاجية الرواية.

في المختبر خلية الثقافة نموذج لاستنشاق الفحوصات الكيميائية السامة

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

in-vitro-cell-culture-model-for-toxic-inhaled-chemical-testing

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

10.6K Views.  University of Colorado.  تم تصميم هذا البروتوكول لإظهار طريقة التعرض للثقافات الخلية لاستنشاق المواد الكيميائية السامة. تعرض متباينة واجهة الهواء السائل (علي) الثقافات من الخلايا الظهارية الهوائية يوفر نموذجا فريدا للتعرض الشعب الهوائية للغازات السامة مثل الكل?...

Video: In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in vitro. Nutrients delivered by vasculature fail to reach all parts of tumors, giving rise to heterogeneous microenvironments consisting of viable, quiescent and necrotic cell types. Many cancer drugs fail to effectively penetrate and treat all types of cells because of this heterogeneity. Monolayers of cancer cells do not mimic this heterogeneity, making it difficult to test cancer drugs with a suitable in vitro model. Our microfluidic devices were fabricated out of PDMS using soft lithography. Multicellular tumor spheroids, formed by the hanging drop method, were inserted and constrained into rectangular chambers on the device and maintained with continuous medium perfusion on one side. The rectangular shape of chambers on the device created linear gradients within tissue. Fluorescent stains were used to quantify the variability in apoptosis within tissue. Tumors on the device were treated with the fluorescent chemotherapeutic drug doxorubicin, time-lapse microscopy was used to monitor its diffusion into tissue, and the effective diffusion coefficient was estimated. The hanging drop method allowed quick formation of uniform spheroids from several cancer cell lines. The device enabled growth of spheroids for up to 3 days. Cells in proximity of flowing medium were minimally apoptotic and those far from the channel were more apoptotic, thereby accurately mimicking regions in tumors adjacent to blood vessels. The estimated value of the doxorubicin diffusion coefficient agreed with a previously reported value in human breast cancer. Because the penetration and retention of drugs in solid tumors affects their efficacy, we believe that this device is an important tool in understanding the behavior of drugs, and developing new cancer therapeutics.

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We present the procedure for fabrication and operation of a microfluidic device that recreates heterogeneous tumor microenvironments in vitro. The variability in apoptosis within tumor tissue was quantified using fluorescent stains and the effective diffusion coefficient of the chemotherapeutic drug doxorubicin into tumor tissue was evaluated.

ميكروفلويديك الأجهزة لإعادة تأسيس المكروية ورم<em&gt; في المختبر</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

Shape Memory Polymers for Active Cell Culture

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent shape upon the application of a stimulus such as heat1-5. In a typical shape memory cycle, the SMP is first deformed at an elevated temperature that is higher than its transition temperature, Ttrans [either the melting temperature (Tm) or the glass transition temperature (Tg)]. The deformation is elastic in nature and mainly leads to a reduction in conformational entropy of the constituent network chains (following the rubber elasticity theory). The deformed SMP is then cooled to a temperature below its Ttrans while maintaining the external strain or stress constant. During cooling, the material transitions to a more rigid state (semi-crystalline or glassy), which kinetically traps or "freezes" the material in this low-entropy state leading to macroscopic shape fixing. Shape recovery is triggered by continuously heating the material through Ttrans under a stress-free (unconstrained) condition. By allowing the network chains (with regained mobility) to relax to their thermodynamically favored, maximal-entropy state, the material changes from the temporary shape to the permanent shape.
Cells are capable of surveying the mechanical properties of their surrounding environment6. The mechanisms through which mechanical interactions between cells and their physical environment control cell behavior are areas of active research. Substrates of defined topography have emerged as powerful tools in the investigation of these mechanisms. Mesoscale, microscale, and nanoscale patterns of substrate topography have been shown to direct cell alignment, cell adhesion, and cell traction forces7-14. These findings have underscored the potential for substrate topography to control and assay the mechanical interactions between cells and their physical environment during cell culture, but the substrates used to date have generally been passive and could not be programmed to change significantly during culture. This physical stasis has limited the potential of topographic substrates to control cells in culture.
Here, active cell culture (ACC) SMP substrates are introduced that employ surface shape memory to provide programmed control of substrate topography and deformation. These substrates demonstrate the ability to transition from a temporary grooved topography to a second, nearly flat memorized topography. This change in topography can be used to control cell behavior under standard cell culture conditions.

A method for developing cell culture substrates with the ability to change topography during culture is described. The method makes use of smart materials known as shape memory polymers that have the ability to memorize a permanent shape. This concept is adaptable to a wide range of materials and applications.

البوليمرات الذاكرة شكل خلية للثقافة أحدث

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent ...

Autologous Endothelial Progenitor Cell-Seeding Technology and Biocompatibility Testing For Cardiovascular Devices in Large Animal Model

Implantable cardiovascular devices are manufactured from artificial materials (e.g. titanium (Ti), expanded polytetrafluoroethylene), which pose the risk of thromboemboli formation1,2,3. We have developed a method to line the inside surface of Ti tubes with autologous blood-derived human or porcine endothelial progenitor cells (EPCs)4. By implanting Ti tubes containing a confluent layer of porcine EPCs in the inferior vena cava (IVC) of pigs, we tested the improved biocompatibility of the cell-seeded surface in the prothrombotic environment of a large animal model and compared it to unmodified bare metal surfaces5,6,7 (Figure 1). This method can be used to endothelialize devices within minutes of implantation and test their antithrombotic function in vivo. 
Peripheral blood was obtained from 50 kg Yorkshire swine and its mononuclear cell fraction cultured to isolate EPCs4,8. Ti tubes (9.4 mm ID) were pre-cut into three 4.5 cm longitudinal sections and reassembled with heat-shrink tubing. A seeding device was built, which allows for slow rotation of the Ti tubes. 
We performed a laparotomy on the pigs and externalized the intestine and urinary bladder. Sharp and blunt dissection was used to skeletonize the IVC from its bifurcation distal to the right renal artery proximal. The Ti tubes were then filled with fluorescently-labeled autologous EPC suspension and rotated at 10 RPH x 30 min to achieve uniform cell-coating9. After administration of 100 USP/ kg heparin, both ends of the IVC and a lumbar vein were clamped. A 4 cm veinotomy was performed and the device inserted and filled with phosphate-buffered saline. As the veinotomy was closed with a 4-0 Prolene running suture, one clamp was removed to de-air the IVC. At the end of the procedure, the fascia was approximated with 0-PDS (polydioxanone suture), the subcutaneous space closed with 2-0 Vicryl and the skin stapled closed. 
After 3 - 21 days, pigs were euthanized, the device explanted en-block and fixed. The Ti tubes were disassembled and the inner surfaces imaged with a fluorescent microscope.
We found that the bare metal Ti tubes fully occluded whereas the EPC-seeded tubes remained patent. Further, we were able to demonstrate a confluent layer of EPCs on the inside blood-contacting surface.
Concluding, our technology can be used to endothelialize Ti tubes within minutes of implantation with autologous EPCs to prevent thrombosis of the device. Our surgical method allows for testing the improved biocompatibility of such modified devices with minimal blood loss and EPC-seeded surface disruption.

A method for seeding titanium blood-contacting biomaterials with autologous cells and testing biocompatibility is described. This method uses endothelial progenitor cells and titanium tubes, seeded within minutes of surgical implantation into porcine venae cavae. This technique is adaptable to many other implantable biomedical devices.

غشائي ذاتي السلف الخلوي البذر التكنولوجيا واختبار توافق مع الحياة للحصول على أجهزة القلب والأوعية الدموية في نموذج حيواني كبير

Implantable cardiovascular devices are manufactured from artificial materials (e.g. titanium (Ti), expanded polytetrafluoroethylene), which pose the risk ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

The field of human trophoblast research aids in understanding the complex environment established during placentation. Due to the nature of these studies, human in vivo experimentation is impossible. A combination of primary cultures, explant cultures and trophoblast cell lines1 support our understanding of invasion of the uterine wall2 and remodeling of uterine spiral arteries3,4 by extravillous trophoblast cells (EVTs), which is required for successful establishment of pregnancy. Despite the wealth of knowledge gleaned from such models, it is accepted that in vitro cell culture models using EVT-like cell lines display altered cellular properties when compared to their in vivo counterparts5,6. Cells cultured in the rotating cell culture system (RCCS) display morphological, phenotypic, and functional properties of EVT-like cell lines that more closely mimic differentiating in utero EVTs, with increased expression of genes mediating invasion (e.g. matrix metalloproteinases (MMPs)) and trophoblast differentiation7,8,9. The Saint Georges Hospital Placental cell Line-4 (SGHPL-4) (kindly donated by Dr. Guy Whitley and Dr. Judith Cartwright) is an EVT-like cell line that was used for testing in the RCCS.
The design of the RCCS culture vessel is based on the principle that organs and tissues function in a three-dimensional (3-D) environment. Due to the dynamic culture conditions in the vessel, including conditions of physiologically relevant shear, cells grown in three dimensions form aggregates based on natural cellular affinities and differentiate into organotypic tissue-like assemblies10,11,12 . The maintenance of a fluid orbit provides a low-shear, low-turbulence environment similar to conditions found in vivo. Sedimentation of the cultured cells is countered by adjusting the rotation speed of the RCCS to ensure a constant free-fall of cells. Gas exchange occurs through a permeable hydrophobic membrane located on the back of the bioreactor. Like their parental tissue in vivo, RCCS-grown cells are able to respond to chemical and molecular gradients in three dimensions (i.e. at their apical, basal, and lateral surfaces) because they are cultured on the surface of porous microcarrier beads. When grown as two-dimensional monolayers on impermeable surfaces like plastic, cells are deprived of this important communication at their basal surface. Consequently, the spatial constraints imposed by the environment profoundly affect how cells sense and decode signals from the surrounding microenvironment, thus implying an important role for the 3-D milieu13.
We have used the RCCS to engineer biologically meaningful 3-D models of various human epithelial tissues7,14,15,16. Indeed, many previous reports have demonstrated that cells cultured in the RCCS can assume physiologically relevant phenotypes that have not been possible with other models10,17-21. In summary, culture in the RCCS represents an easy, reproducible, high-throughput platform that provides large numbers of differentiated cells that are amenable to a variety of experimental manipulations. 
In the following protocol, using EVTs as an example, we clearly describe the steps required to three-dimensionally culture adherent cells in the RCCS.

Traditional, two dimensional cell culture techniques often result in altered characteristics with respect to differentiation markers, cytokines and growth factors. Three-dimensional cell culture in the rotating cell culture system (RCCS) reestablishes expression of many of these factors as shown here with an extravillous trophoblast cell line.

نظم الدورية الثقافة خلية خلية للثقافة الإنسان : خلايا الأرومة الغاذية الإنسان نموذجا

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

العين تهيج اختبار (EIT) لتحديد مخاطر العين مهيج للمواد الكيميائية باستخدام يعيد الإنسان القرنية مثل الظهارية (RHCE) الأنسجة نموذج

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

تشكيل الضوء بوساطة والزخرفة من الهلاميات المائية للتطبيقات خلية ثقافة

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

ل<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج الثقافة الجهاز من الفئران فقرات القرص

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Methodology for Biomimetic Chemical Neuromodulation of Rat Retinas with the Neurotransmitter Glutamate In Vitro

Photoreceptor degenerative diseases cause irreparable blindness through the progressive loss of photoreceptor cells in the retina. Retinal prostheses are an emerging treatment for photoreceptor degenerative diseases that seek to restore vision by artificially stimulating the surviving retinal neurons in the hope of eliciting comprehensible visual perception in patients. Current retinal prostheses have demonstrated success in restoring limited vision to patients using an array of electrodes to electrically stimulate the retina but face substantial physical barriers in restoring high acuity, natural vision to patients. Chemical neurostimulation using native neurotransmitters is a biomimetic alternative to electrical stimulation and could bypass the fundamental limitations associated with retinal prostheses using electrical neurostimulation. Specifically, chemical neurostimulation has the potential to restore more natural vision with comparable or better visual acuities to patients by injecting very small quantities of neurotransmitters, the same natural agents of communication used by retinal chemical synapses, at much finer resolution than current electrical prostheses. However, as a relatively unexplored stimulation paradigm, there is no established protocol for achieving chemical stimulation of the retina in vitro. The purpose of this work is to provide a detailed framework for accomplishing chemical stimulation of the retina for investigators who wish to study the potential of chemical neuromodulation of the retina or similar neural tissues in vitro. In this work, we describe the experimental setup and methodology for eliciting retinal ganglion cell (RGC) spike responses similar to visual light responses in wild-type and photoreceptor-degenerated wholemount rat retinas by injecting controlled volumes of the neurotransmitter glutamate into the subretinal space using glass micropipettes and a custom multiport microfluidic device. This methodology and protocol are general enough to be adapted for neuromodulation using other neurotransmitters or even other neural tissues.

Methodology for Biomimetic Chemical Neuromodulation of Rat Retinas with the Neurotransmitter Glutamate In Vitro

This protocol describes a novel method for investigating a form of chemical neurostimulation of wholemount rat retinas in vitro with the neurotransmitter glutamate. Chemical neurostimulation is a promising alternative to the conventional electrical neurostimulation of retinal neurons for treating irreversible blindness caused by photoreceptor degenerative diseases.

منهجية للمحاكاة البيولوجية الكيميائية نيورومودوليشن من الفئران شبكية العين مع العصبي الغلوتامات في المختبر

Photoreceptor degenerative diseases cause irreparable blindness through the progressive loss of photoreceptor cells in the retina. Retinal prostheses are ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

A الإنسان 3D مصفوفة-الخلايا الشحمية نموذج ثقافة لدراسة مصفوفة خليه الأيض الأيضي

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol applies a macromolecular crowding (MMC) technique to mimic this physiological crowding through the addition of neutral polymers (crowders) to cell cultures in vitro. Previous studies using Ficoll or dextran as crowders demonstrate that the expression of collagen I and fibronectin in WI38 and WS-1 cell lines are significantly enhanced using the MMC technique. However, this technique has not been validated in primary hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts (hHSFs). As hypertrophic scarring arises from the excessive deposition of collagen, this protocol aims to construct a collagen-rich in vitro hypertrophic scar model by applying the MMC technique with hHSFs. This optimized MMC model has been shown to possess more similarities with in vivo scar tissue compared to traditional 2-dimensional (2-D) cell culture systems. In addition, it is cost-effective, time-efficient, and ethically desirable compared to animal models. Therefore, the optimized model reported here offers an advanced &#8220;in vivo-like&#8221; model for hypertrophic scar-related studies.

This protocol describes the use of macromolecular crowding to create an in vitro human hypertrophic scar tissue model that resembles in vivo conditions. When cultivated in a crowded macromolecular environment, human skin fibroblasts exhibit phenotypes, biochemistry, physiology, and functional characteristics resembling scar tissue.

في النموذج الفيترو من الإنسان التشعب التشعبي تندب باستخدام الزحام الجزيئي الكلي

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...