لا يزال تحليل المراقبة الجراحية أثناء الجراحة يمثل تحديا كبيرا في جراحات استئصال الورم لأنه يتطلب أداة تشخيصية لتأكيد الاستئصال المعقد للأنسجة السرطانية بدقة وسرعة. من الممكن بعد ذلك تجنب العمليات الجراحية المتكررة بسبب الهامش الجراحي الإيجابي. يمكن أن يوفر الفحص المجهري الضوئي الصوتي فوق البنفسجي المفتوح عالي السرعة صورا نسيجية لعينات الأنسجة في غضون 18 دقيقة مع منطقة تصوير تبلغ خمسة × خمسة ملليمترات مربعة ، مما يدل على إمكانات كبيرة لتحليل الهامش الجراحي أثناء الجراحة.
سيوضح الإجراء Xiufeng Li ، طالب الدكتوراه في السنة النهائية من مختبري. ابدأ بضبط الإضاءة البصرية للنظام المجهري باستخدام ليزر الحالة الصلبة الذي يضخه الصمام الثنائي Q-switch بطول موجي يبلغ 266 نانومتر كمصدر للإثارة. قم بتركيب عدستين محدبتين لتوسيع شعاع الليزر ووضع ثقب بالقرب من النقطة البؤرية للعدسة المحدبة الأولى للتصفية المكانية.
استخدم مرآة الجلفانومتر 1D لتعكس شعاع الليزر لأعلى. بمساعدة العدسة الموضوعية ، ركز شعاع الليزر على عينة. قم بإصلاح UT المركز على شكل حلقة مع المنطقة النشطة التي تواجه الأعلى في خزان مياه مصنوع في المختبر مع نافذة شفافة بصريا في الأسفل مغطاة بغطاء من الكوارتز الرقيق ، ثم قم بتوصيل خزان المياه بمرحلة يدوية ثنائية المحور من المجهر للتحكم في الوضع الجانبي ل UT. عند الانتهاء ، قم بتشغيل ليزر الأشعة فوق البنفسجية واضبط موضع UT للسماح لشعاع الليزر بالمرور عبر مركز UT ، ثم قم بإيقاف تشغيل ليزر الأشعة فوق البنفسجية وملء خزان المياه بالماء منزوع الأيونات لغمر UT بالكامل. قم بتوصيل إخراج UT بمضخمي صوت للحصول على كسب إجمالي قدره 56 ديسيبل ثم قم بتوصيل إخراج مكبر الصوت الثاني ببطاقة الحصول على البيانات ، أو DAQ ، المثبتة في الكمبيوتر.
بعد ذلك ، قم بتوصيل حامل عينة بمرحلة يدوية على المحور z متصلة بمراحل xy بمحرك متبوعة بوضع أربع قطع من الشريط على الوجهين تحيط بالثقب الفارغ لحامل العينة. في وقت لاحق ، تابع محاذاة النظام عن طريق توصيل شريط أسود بشريحة زجاجية ثم وضع الشريحة الزجاجية لتغطية ثقب حامل العينة مع توجيه الشريط الأسود لأسفل. بعد الضغط على الشريحة الزجاجية على حامل العينة، اخفض حامل العينة لغمر الانزلاق الزجاجي في الماء.
افصل UT على شكل حلقة ومكبرات الصوت ، ثم قم بتوصيل UT بالنبض / المستقبل وإخراج النبض / المستقبل إلى مذبذب. قم بتشغيل النبض / المستقبل في وضع صدى النبض مع سعة النبض البالغة ستة وكسب 20 ديسيبل. بمجرد تعيين المعلمات ، اضبط موضع z لحامل العينة ، وحدد موضع المستوى البؤري الصوتي حيث تكون إشارات الموجات فوق الصوتية هي الحد الأقصى.
قم بتغيير النبض / المستقبل إلى وضع الإرسال قبل ضبط الكسب على 60 ديسيبل ، ثم قم بتمكين إخراج الليزر وضبط موضع z للعدسة الموضوعية لزيادة الإشارات الصوتية الضوئية أو PA التي تم قياسها بواسطة الذبذبات. لجعل إشارة PA المتولدة متماثلة وقصوى ، اضبط الموضع الجانبي ل UT على شكل حلقة ، ثم اضبط موضع z لحامل العينة لزيادة إشارات PA إلى أقصى حد. كرر التعديلات الخاصة بموضع z للعدسة الموضوعية وحامل العينة لتحسين تناظر وسعة إشارات PA.
عندما يتم تحسين إشارات PA ، سجل التأخير الزمني أو الوقت الذي تستغرقه موجات PA للوصول إلى UT على الذبذبات. حرك حامل العينة لتصوير مواضع مختلفة من الشريط الأسود. اضبط تسطيح حاملات العينات بحيث يكون لإشارات PA الناتجة من كل موضع من الشريط الأسود نفس التأخير الزمني الذي تم قياسه سابقا.
بعد اكتمال محاذاة النظام، قم بإيقاف تشغيل الليزر وتوصيل UT بمضخمي الصوت. لإعداد شريحة دماغ فأر ثابتة من الفورمالين ومضمنة في البارافين ، ثبت الدماغ الذي تم حصاده في الفورمالين المخزن مؤقتا بنسبة 10٪. بعد 24 ساعة ، قم بمعالجة الدماغ الثابت عن طريق الجفاف باستخدام الكحول المتدرج ، وإزالة الزيلين والتضمين مع البارافين.
استخدم ميكروتوم للحصول على شرائح سميكة من خمسة ميكرومتر من الدماغ المدمج. ضع شرائح العينة على شرائح الكوارتز لتجف في فرن عند 60 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. في وقت لاحق ، قم بإزالة البارافين من أقسام الدماغ باستخدام عامل تطهير لتجنب إشارات الخلفية العالية للبارافين.
لإعداد شريحة جديدة من دماغ الفأر ، اغسل دماغ الفأر الذي تم حصاده باستخدام PBS ثم قم بقطع شريحة بسماكة خمسة ملليمترات من عينة الدماغ باليد تليها غسل شريحة الدماغ باستخدام PBS لإزالة الدم على المقطع العرضي. لوضع العينة، قم بإعداد خزان عينات مصنوع في المختبر مع غشاء بولي إيثيلين شفاف للأشعة فوق البنفسجية بسماكة 10 ميكرومتر، ثم أضف قطرة ماء إلى الغشاء وضع العينة البيولوجية على خزان العينة لتغطية الماء. بعد ذلك ، ضع العينة التي تحتوي على خزان على حامل العينة لضمان تغطية الثقب الفارغ لحامل العينة.
اضبط ليزر الأشعة فوق البنفسجية على وضع الزناد الخارجي واستخدم برنامج عرض المختبر الذي تم إنشاؤه في المختبر لتعيين معلمات المسح الضوئي كما هو موضح في المخطوطة. ابدأ المسح التجريبي على منطقة صغيرة عن طريق تعيين عدد الخطوات المتحركة لمحركات المحور x و y، ثم اضبط المرحلة اليدوية للمحور z لوضع العينة على المستوى البؤري للحصول على أقصى قدر من إشارات PA. بعد نقل كل من محركات المحور x و y إلى نقطة البداية المطلوبة وتعيين منطقة المسح الضوئي عن طريق تعيين قيم xn و yn ، ابدأ تشغيل برنامج الحصول على الصورة.
عندما تكون الصور مطلوبة، قم بإيقاف تشغيل الليزر وإزالة حامل العينة. تخزين الأنسجة البيولوجية الطازجة في 10٪ من الفورمالين المخزن مؤقتا محايد. استخدم إشارات PA التي تم جمعها لإعادة بناء صورة إسقاط السعة القصوى بمساعدة خوارزمية معالجة الصور التي تم إنشاؤها في المختبر.
يظهر التحليل التمثيلي صور UV-PAM و H & E لشريحة دماغ فأر FFPE. في صورة UV-PAM المكبرة ، يمكن حل نوى الخلية الفردية. تم العثور على نوى الخلايا المقابلة في الصور القياسية الملطخة H & E ، مما يدل على الدقة العالية للنظام الحالي للتصوير الخلوي.
تم تطبيق خوارزمية التعلم العميق لنقل صورة UV-PAM ذات المقياس الرمادي إلى صورة افتراضية ملطخة ب H & E. من المهم ضبط موضع محول الموجات فوق الصوتية على شكل حلقة للسماح لضوء الأشعة فوق البنفسجية بالمرور عبر مركز أثناء محاذاة النظام. وهذا يضمن إمكانية الحصول على إشارة صوتية ضوئية قابلة للكشف وتحسينها بشكل أكبر عند تشغيل الليزر.
يمكن دمج خوارزمية التصنيف الخاصة بنا بشكل أكبر لتصنيف الورم والمناطق الطبيعية في الصور ، لتكون بمثابة تصوير مساعد ومنصة تشخيصية للمهنيين الطبيين.
