نشكر جيف دانيلز للحصول على المساعدة الفنية. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل R01 AI067946 لJSO

1. Coverslips معطف مع الجسم المضاد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Prewarm (عند 37 درجة مئوية) 30 مل من RPMI 10٪ FCS وسائل الإعلام 1 مل من BD Cytofix / Cytoperm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل من 5 ميكروغرام / مل من الأضداد المنقى في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). لتفعيل خط الخلية NK92، استخدام الألغام المضادة للCD18 ومكافحة NKp30 ينصح. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علامة واحدة تقريبا عشرة سنتات دائرة الحجم لكل حالة على ساترة # 1.5 باستخدام القلم PAP. لتجربة اللون المزدوج، يجب أن يكون هناك أربعة شروط: غير ملوثين، ملطخة المزدوج، وشرطين الملون واحد. الاستغناء 200 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة في كل منطقة واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل coverslips بغمر بلطف كل واحد في 50 مل من برنامج تلفزيوني في أنبوب 50 مل المخروطية في درجة حرارة الغرفة. ينبغي أن يحدث الغسيل مباشرة قبل إضافة ينبغي أن تؤخذ الخلايا والحرص على تجنب تجفيف الجسم المضاد على ساترة. </li></ol></li></ol> 2. تنشيط خلايا NK على الغلافزلات؛ فيكس وPermeabilize <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل 5 × 10 5 خلايا لكل NK92 الشرط. أجهزة الطرد المركزي وطاف صب. يغسل مرة واحدة مع 10 مل وسائل الاعلام prewarmed من الخطوة 1.1. أجهزة الطرد المركزي وطاف صب. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا resuspend في وسائل الاعلام prewarmed من الخطوة 1.1 بتركيز 2.5 × 10 6 / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب بلطف 200 ميكرولتر من وسط المنطقة بإنشائه في قسم 1.2.1. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في 5٪ CO 2. (ملاحظة: هذه المرة يمكن تمديدها أو ينقص تبعا لوظيفة بيولوجية من الفائدة للNK الخلية الحبيبية الاستقطاب، 20 دقيقة كافية). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد حضانة الخلايا، وغسل بلطف coverslips بغمر كل في 50 مل من درجة حرارة الغرفة PBS في أنبوب 50 مل المخروطية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 ميكرولتر من تريتون X-100-1 مل من prewarmed حل فيكس / بيرم من الخطوة 1.1 ودوامة بدقة. إصلاح وpermeabilize بإضافة 200 ميكرولتر من فيكس / بيرم العازلة (الخطوة 2.3) إلى الخلايا. احتضان لمدة 10 مترفي في الظلام في درجة حرارة الغرفة. </li></ol> 3. خلايا وصمة عار <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد تلطيخ العازلة: الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، 1٪ BSA، 0.1٪ سابونين. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير محلول الأجسام المضادة الأولية في 200 ميكرولتر تلطيخ العازلة (انظر الخطوة 3.1). (ملاحظة: يجب معاير الأجسام المضادة قبل استخدامها). تجنب استخدام الأجسام المضادة الأولية الذي يظهر في نفس الأنواع المستخدمة في معطف ساترة (الخطوة 1.2). أيضا تجنب الروابط Strepatividin البيوتين لSTED التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2.3.1 القسم التالي، وغسل بلطف coverslips في 50 مل تلطيخ العازلة. ربت حواف المنطقة PAP من ركلة جزاء مع مسحة القطن لإزالة العازلة الزائدة. تطبيق حل الأجسام المضادة التي تم إنشاؤها في القسم 3.1.1. احتضان 30 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة. (الموصى به: احتضان coverslips في مربع الشريحة مع منشفة ورقية رطبة للحفاظ على الرطوبة). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد حل الضد الثانوية في 200 ميكرولتر تلطيخالعازلة. fluorophores الموصى بها اليكسا فلور 488، والمحيط الهادئ أورانج، وV500. عموما، وهو 1:200 التخفيف مناسبة لSTED التصوير. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل بلطف coverslips في 50 مل تلطيخ العازلة. ربت حواف المنطقة PAP من ركلة جزاء مع مسحة القطن لإزالة العازلة الزائدة. تطبيق حل الضد الثانوية. احتضان 30 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار الغسيل وتلطيخ للبروتينات إضافية من الفائدة. إذا كشف F-الأكتين مع Phalloidin، وهذا يمكن أن تدرج مع الأجسام المضادة الثانوية، وعموما في التخفيف 1:200. </li></ol> 4. جبل Coverslips على الشرائح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد تصاعد المتوسط. ملاحظة: إطالة أو إطالة الذهب هي الأفضل. VECTASHIELD يجب تجنبها، لأنها ليست متوافقة مع STED. يجب تجنب 2،2-thiodioethanol إذا تم استخدام Phalloidin. Mowiol غير مقبول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع حوالي 10-20 ميكرولتر من تصاعد المتوسطة على شريحة. عكس ساترة (الجانب الخلية أسفل) وجبل ساترة بلطف، مع الحرص علىتجنب إدخال فقاعات الهواء. احتضان الشرائح لمدة 24 ساعة (ساترة متابعة) قبل التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم حواف ساترة مع طلاء الأظافر. </li></ol> 5. الإعداد التجريبية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء الليزر والبرمجيات اللازمة. بدء نضوب STED الليزر على الطاقة 100٪. محاذاة STED الليزر، والتي في حالة الأنظمة التجارية في كثير من الأحيان إجراء الآلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تركيز العينة، التي تبدأ مع التحكم الملون واحد، على المجهر باستخدام العدسات. </li></ol> 6. تعظيم الاستفادة من إعدادات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسح القناة الأولى وتحسين قوة الليزر، موقف الإثارة شعاع ومجموعة كاشف. إذا كان ذلك ممكنا، تجنب كسب&gt; 100. التقاط الصورة في متحد البؤر لتحسين الإعدادات. سوف الخط و / أو الإطار المتوسط ​​زيادة القرار. التحقق من وجود بكسل التشبع. ملاحظة: بعض التشبع هو مقبول في متحد البؤر عن تطبيق STED سوف يقلل من كثافة الانبعاثات. لSTED، وحجم البكسل يكون الأمثل أقل من 30 نانومتر كيفوسيتم الحصول على أفضل قرار من أي وقت مضى مع أحجام أصغر بكسل. فإن حجم المنطقة ذات الاهتمام التي يجري تصويرها تملي الحد الأدنى من حجم بكسل. أحجام بكسل أصغر قد تزيد photobleaching من. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق STED استنزاف شعاع والتقاط الصور، بدءا من 50٪ استنزاف قوة الليزر. إذا رأيت تحسنا في القرار، ويمكن تطبيق أكثر استنزاف قوة الليزر. في هذه المرحلة، قد يكون من الضروري لضبط قوة الإثارة ليزر، خط المتوسط، و / أو مكسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق الساعة النابضة للحد من الخلفية (الحد الأدنى 0.3 NSEC). ضبط الإعدادات حتى يمكن رؤية تحسن في القرار أكثر من متحد البؤر. قرار يمكن أن يقترب عن طريق تقدير كامل عرض نصف كحد أقصى (FWHM). هذا يمثل المسافة في نصف كثافة القصوى من ذروة التمويه إنشاؤها عن طريق رسم خط صورة عبر بنية الفائدة، وهي الطريقة المستخدمة على نطاق واسع لتقدير القرار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة القناة الأولى هي مرضية، والشروع في سلسلة ثانية لذاتهquential المسح. بشكل عام، فمن الأفضل أن تفحص أطول الطول الموجي fluorophore الأولى. كرر الخطوة 6.1 على القناة الثانية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكيد عدم وجود التداخل الطيفي بواسطة التصوير الملون الضوابط واحدة مع كل من تسلسل المسح الضوئي. يمكن تصحيح التداخل الطيفي باستخدام ميزات خفيفة لخلط الامم المتحدة الطيفية في البرنامج، ولكن يجب تجنب كلما كان ذلك ممكنا. </li></ol> 7. الحصول على الصور <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على صور. للتصوير الكمي، فمن المستحسن للحصول على ما لا يقل عن 20 الصور / حالة. العدد الدقيق، ومع ذلك، ينبغي أن تحدد وفقا لمسألة تجريبية بالتنسيق مع نهج الإحصائية مثل حساب حجم العينة. حفظ التجربة. </li></ol> 8. Deconvolution <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح ملف مع برنامج deconvolution أو دفعة المعالج. تحقق المعلمات لكل قناة باستخدام البرمجيات. تأكيد الإثارة وانبعاث أطياف كل قناة، STED الانبعاثات نضوب، والتصوير المباشرهنشوئها (صعودا أو هبوطا، إذا كانت الصورة 3 الأبعاد) على وجه الخصوص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Deconvolve استخدام المعالج deconvolution. الإعدادات الافتراضية هي كافية عموما، ومع ذلك إشارة إلى نسبة الضوضاء (SNTR) سوف تختلف من fluorophore fluorophore لوسوف تحتاج إلى أن تحدد لكل قناة وكل تجربة على حدة. </li></ol>

<ol>
	<li>Stinchcombe, J. C., Bossi, G., Booth, S., Griffiths, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+synapse+of+CTL+contains+a+secretory+domain+and+membrane+bridges.">The immunological synapse of CTL contains a secretory domain and membrane bridges.</a> Immunity. 15 (5), 751-761 (2001).</li><li>Grakoui, A., Bromley, S. K., Sumen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+synapse:+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation.">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li><li>Monks, C. R., Freiberg, B. A., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells.">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).</li><li>Orange, J. S., Harris, K. E., Andzelm, M. M., Valter, M. M., Geha, R. S., Strominger, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mature+activating+natural+killer+cell+immunologic+synapse+is+formed+in+distinct+stages.">The mature activating natural killer cell immunologic synapse is formed in distinct stages.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (24), 14151-14156 (2003).</li><li>Treanor, B., Lanigan, P. M., Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microclusters+of+inhibitory+killer+immunoglobulin-like+receptor+signaling+at+natural+killer+cell+immunological+synapses.">Microclusters of inhibitory killer immunoglobulin-like receptor signaling at natural killer cell immunological synapses.</a> J. Cell Biol. 174 (1), 153-161 (2006).</li><li>Abeyweera, T. P., Merino, E., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+signaling+blocks+activating+receptor+clustering+and+induces+cytoskeletal+retraction+in+natural+killer+cells.">Inhibitory signaling blocks activating receptor clustering and induces cytoskeletal retraction in natural killer cells.</a> J. Cell Biol. 192 (4), 675-690 (2011).</li><li>Beemiller, P., Jacobelli, J., Krummel, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+the+movement+of+signaling+microclusters+with+cellular+motility+in+immunological+synapses.">Integration of the movement of signaling microclusters with cellular motility in immunological synapses.</a> Nat. Immunol. 13 (8), 787-795 (2012).</li><li>Campi, G., Varma, R., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+and+agonist+MHC-peptide+complex-dependent+T+cell+receptor+microclusters+as+scaffolds+for+signaling.">Actin and agonist MHC-peptide complex-dependent T cell receptor microclusters as scaffolds for signaling.</a> J. Exp. Med. 202 (8), 1031-1036 (2005).</li><li>Mossman, K. D., Campi, G., Groves, J. T., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+TCR+signaling+from+geometrically+repatterned+immunological+synapses.">Altered TCR signaling from geometrically repatterned immunological synapses.</a> Science. 310 (5751), 1191-1193 (2005).</li><li>Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+receptor-proximal+signals+are+sustained+in+peripheral+microclusters+and+terminated+in+the+central+supramolecular+activation+cluster.">T cell receptor-proximal signals are sustained in peripheral microclusters and terminated in the central supramolecular activation cluster.</a> Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).</li><li>Yokosuka, T., Sakata-Sogawa, K., Kobayashi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newly+generated+T+cell+receptor+microclusters+initiate+and+sustain+T+cell+activation+by+recruitment+of+Zap70+and+SLP-76.">Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76.</a> Nat. Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).</li><li>Toomre, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+wave+of+cellular+imaging.">A new wave of cellular imaging.</a> Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 285-314 (2010).</li><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> J. Cell Biol. 190 (2), 165-175 (2010).</li><li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+microscopy.">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annu. Rev. Biochem. 78, 993-1016 (2009).</li><li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+views+of+the+human+NK+cell+immunological+synapse:+recent+advances+enabled+by+super-+and+high-resolution+imaging+techniques.">New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques.</a> Front. Immunol. 3, 421 (2012).</li><li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission:+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy.">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Opt. Lett. 19 (11), 780-782 (1994).</li><li>Klar, T. A., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction+resolution+in+far-field+fluorescence+microscopy.">Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy.</a> Opt. Lett. 24 (14), 954-956 (1999).</li><li>Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy+with+diffraction+resolution+barrier+broken+by+stimulated+emission.">Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (15), 8206-8210 (2000).</li><li>Rankin, B. R., Moneron, G., Wurm, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscopy+in+a+living+multicellular+organism+expressing+GFP.">Nanoscopy in a living multicellular organism expressing GFP.</a> Biophys. J. 100 (12), 63-65 (2011).</li><li>Willig, K. I., Kellner, R. R., Medda, R., Hein, B., Jakobs, S., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+resolution+in+GFP-based+microscopy.">Nanoscale resolution in GFP-based microscopy.</a> Nat. Methods. 3 (9), 721-723 (2006).</li><li>Rak, G. D., Mace, E. M., Banerjee, P. P., Svitkina, T., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cell+lytic+granule+secretion+occurs+through+a+pervasive+actin+network+at+the+immune+synapse.">Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse.</a> PLoS Biol. 9 (9), (2011).</li><li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+channel+STED+nanoscopy+of+lytic+granules+on+actin+filaments+in+natural+killer+cells.">Dual channel STED nanoscopy of lytic granules on actin filaments in natural killer cells.</a> Commun. Integr. Biol. 5 (2), 184-186 (2012).</li><li>Singh, H., Lu, R., Rodriguez, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+quantification+of+cardiac+mitochondrial+protein+clusters+with+STED+microscopy.">Visualization and quantification of cardiac mitochondrial protein clusters with STED microscopy.</a> Mitochondrion. 12 (2), 230-236 (2012).</li><li>Tonnesen, J., Nagerl UV, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+imaging+for+neuroscience.">Superresolution imaging for neuroscience.</a> Exp. Neurol. 242, 33-40 (2013).</li><li>Kempf, C., Staudt, T., Bingen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+multicolor+STED+nanoscopy+of+presynaptic+proteins+in+the+calyx+of+held.">Tissue multicolor STED nanoscopy of presynaptic proteins in the calyx of held.</a> PLoS One. 8 (4), (2013).</li><li>Jans, D. C., Wurm, C. A., Riedel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+super-resolution+microscopy+reveals+an+array+of+MINOS+clusters+along+human+mitochondria.">STED super-resolution microscopy reveals an array of MINOS clusters along human mitochondria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (22), 8936-8941 (2013).</li><li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198 (2), 82-87 (2000).</li><li>Gustafsson, M. G., Shao, L., Carlton, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination).">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination).</a> Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li><li>Schermelleh, L., Carlton, P. M., Haase, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction+multicolor+imaging+of+the+nuclear+periphery+with+3D+structured+illumination+microscopy.">Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy.</a> Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).</li><li>Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 13 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy.">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Nat. Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Banerjee, P. P., Pandey, R., Zheng, R., Suhoski, ., Monaco-Shawver, L., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42-interacting+protein-4+functionally+links+actin+and+microtubule+networks+at+the+cytolytic+NK+cell+immunological.">Cdc42-interacting protein-4 functionally links actin and microtubule networks at the cytolytic NK cell immunological.</a> J. Exp. Med. 204 (10), 2305-2320 (2007).</li><li>Vicidomini, G., Moneron, G., Han, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sharper+low-power+STED+nanoscopy+by+time+gating.">Sharper low-power STED nanoscopy by time gating.</a> Nat. Methods. 8 (7), 571-573 (2011).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة. وقد تحملت تكاليف نشر جزئية من هذه المادة من قبل لايكا مايكروسيستمز، وشركة

فإن التحسن في القرار على أن يعتمد إلى حد ما متحد البؤر على العوامل التي لا يمكن السيطرة عليها. وتشمل هذه العوامل الانحرافات الطفيفة في سماكة الغطاء زلة والتناقضات في وسائل الإعلام في تصاعد مستمر. فمن المهم للحفاظ على درجة الحرارة والرطوبة في غرفة التصوير متسقة قدر الإمكان، وينبغي إعادة ترتيب شعاع STED تقريبا كل 60 دقيقة. كما ذكر في الإجراءات، ويجب تجنب استخدام VECTASHIELD المتوسطة المتزايدة، وهذا غير متوافق مع STED. بالإضافة إلى هذا، ينبغي للمرء دائما استخدام # 1.5 زلات الغطاء، وإذا كانت متوفرة، استخدام تلك التي تم التحقق منها لسمك معين. واحد من تعديل النهج وصفها هنا هو صورة قنوات إضافية في متحد البؤر، وذلك باستخدام fluorophores التي تنبعث منها في طول موجة أطول من شعاع STED. بهذه الطريقة، يمكن للمرء صورة يصل إلى أربع قنوات (اثنان في متحد البؤر، واثنان في STED). إذا أخذ هذا النهج، ومع ذلك، فإن قنوات مع fluorophores الإلكترونيةسوف mitting أعلاه استنزاف الليزر STED تحتاج إلى تصوير أول، وتطبيق شعاع STED سوف تستنزف الفوتونات في هذه القنوات. واحدة ميزة لهذه التقنية هو تطبيق من الوقت النابضة، والتي سوف تحسن أيضا في القرار متحد البؤر من خلال القضاء على الانبعاثات من الفوتونات مع أعمار قصيرة 34. على وجه الخصوص، فإن استخدام النابضة الوقت، توقيت كشف الانبعاثات لتتوافق مع الإثارة نابض STED، وانخفاض مضان الخلفية من انعكاس قبالة الزجاج ساترة عند التصوير على مقربة منه. حتى في تجربة لا تصلح للSTED، إذا باستخدام مصدر الإثارة نابض، يمكن للزمن النابضة تكون أداة مفيدة لتحسين القرار في متحد البؤر. هناك العديد من التعديلات التي يمكن استخدامها لتحسين القرار في STED. واحد هو تقليل حجم الثقب من مستوى 1 إيري حدة، على الرغم من أن هذا سوف أيضا تقليل كمية من الضوء تصل إلى العينة. وهذا يمكن أن يتم تعويضهم عن طريق زيادة لاسإيه السلطة أو تحقيق مكاسب. هو آخر لزيادة خط المتوسط، الأمر الذي سيزيد من كمية المعلومات التي تم جمعها عن كل فوتون، وتحسين القرار. مرة أخرى، ومع ذلك، قد يكون هذا على حساب photobleaching من العينة، لذلك سوف تحتاج إلى التوازن الذي يجب إقامته بين القرار والتبييض. وبالمثل، فإن استخدام البروتينات الفلورية مثل GFP تتطلب التحسين الحذر لتجنب التبييض. ويمكن تحقيق هذا عن طريق تقليل قوة الليزر STED إذا لزم الأمر. نقاط قتا أطول سوف تسمح أيضا لمزيد من الانتعاش والحد من الفوتون التبييض. ينبغي أخذها في الاعتبار تصحيح ل photobleaching ليعيش عند تحليل STED. بطبيعة الحال، والتصوير في 3 أبعاد في STED الممكن أيضا، وسوف تعطي أيضا تحسنا التصوير متحد البؤر التقليدية. هل هذا صحيح لا سيما إذا كان يتم ذلك بالاشتراك مع deconvolution، على الرغم من الرعاية التي ينبغي اتخاذها لتصحيح الانحراف الذي يحدث أثناء التصوير طائرات متعددة في محور ض. إذا باستخدام برنامج هيغنزلdeconvolve، يتم الحصول على هذا التصحيح باستخدام &quot;استقرار الصورة&quot; الميزة. باستخدام هذا النهج، سيتم تحسين القرار في محور ض. هذا هو تحسنا كبيرا خلال التصوير متحد البؤر التقليدية، التي لديها ضعف القرار المحوري، وحتى على STED نفسها فقط، التي لديها أيضا فقيرة نسبيا القرار ض محور. حين الحصول على أكوام متعددة في STED، يجب توخي الحذر لتجنب التبييض من العينة، وإذا كان أحد يمكن أن تقلل من الضروري الخط المتوسط ​​أو الليزر كثافة الطاقة من أجل القيام بذلك. مرة أخرى، تجدر الإشارة إلى أنه إذا كان التصوير fluorophores الأخرى التي ليست مناسبة للSTED، وتطبيق شعاع نضوب في أول مسح متتابعة من شأنه أن يمنع الانبعاثات من هذه القنوات. وبالتالي، نهج STED / متحد البؤر مختلطة (عند استخدام المسح متحد البؤر في القنوات التي تنبعث منها في طول موجة أكبر من 592 نانومتر) للأسف لن تكون مناسبة ل3D. لتلخيص، فقد اخترنا STED كنهج بسبب السهولة النسبية المتمثلة في التطبيقlication والتحسن في القرار على التصوير متحد البؤر القياسية. لتصوير المشبك المناعي، فإنه قد ثبت تقنية فعالة وقيمة أن يسمح لنا أن نرى التفاصيل في العمارة F-الأكتين غير ممكن في القرار أكثر من 200 نانومتر. في حين أن العديد من هذه التفاصيل تبدو خفية، فإنها يمكن أن يكون لها تأثير عميق على وظيفة خلايا NK. وبالتالي، نحن نطبق أحدث تكنولوجيا التصوير نانوية لاستخلاص المعلومات التي تعتبر ضرورية للحفاظ على صحة الإنسان.

المشبك المناعية هو بيئة معقدة من الإشارات البروتينات والعناصر هيكل الخلية. وقد وصفت المشبك لحل الخلايا أصلا بأنها &quot;الثيران العين&quot; مثل هيكل مع حلقة من الأكتين والتصاق جزيئات المحيطة مجال إفرازية المركزي 1-4. ومع ذلك، ونحن نعلم الآن أنه يتكون من المجالات المجهرية من إشارات النشطة التي تتطلب إعادة تنظيم هيكل الخلية الحيوية المستمر من أجل وظيفة 5-11. استمدت الكثير من المعلومات التي لدينا الآن حوالي المشبك من المجهري، وكانت المناعة الأوائل من تكنولوجيا التصوير المتطورة. واحدة من هذه التكنولوجيا هو رواية فائقة القرار المجهري. المجهر الضوئي التقليدية محدودة مكانيا من قبل حاجز حيود الضوء، والذي يحدد الحد الأدنى من القرار لجميع المجهري مضان، بما في ذلك متحد البؤر، في حوالي 200 نانومتر. في السنوات الأخيرة، كانت عدة تقنيات المطورد التي تسمح القرار دون حاجز الحيود. وتشمل هذه الانبعاثات التحفيز استنزاف المجهري (STED)، منظم المجهري الإضاءة (SIM)، المجهري حل عشوائيا (STORM)، والمجهر الضوئي photoactivatable (النخيل). وقد تم استعراض هذه التقنيات بالتفصيل في مكان آخر 12-15، ولكن ترد أدناه. يتم إنشاء Subdiffraction القرار محدودة بطرق فريدة من نوعها في كل نظام. اختيار تقنية فائقة الدقة، وبالتالي، يجب أن تمليها التجربة والنظام التجريبي من الفائدة. ويتحقق القرار السوبر STED باستخدام عالية الكثافة torroidal استنزاف شعاع التي انتقائي &quot;الصمت&quot; مضان حول كل fluorophore من الفائدة التالية الإثارة، مما أدى إلى subdiffraction محدودة المجهري مضان 16-18. ميزة واحدة من STED هو أن الحصول على الصور سريعا ويتطلب القليل نسبيا مرحلة ما بعد المعالجة. في حين أملت اختيار صبغة من المواصفاتموقف ترال من شعاع نضوب، والتي تقع في النظام المتوفرة تجاريا في 592 نانومتر، تتوفر العديد من الأصباغ المتاحة تجاريا التي تجعل مجموعات من اثنين fluorophores ممكن. بالإضافة إلى ذلك، تستخدم عادة للصحفيين الفلورسنت مثل GFP يمكن تصويرها، مما يجعل التجارب الخلية الحية ممكن 19،20. وقد استخدمنا في السابق STED لتحديد مناطق hypodensity F-الأكتين التي تستخدم من قبل خلايا NK للتحبب 21،22 وكميا. نقترح أن STED هو خيار جيد لتصوير المشبك المناعي، نظرا لتوافر مرونة نسبيا من fluorophores وتحسين متفوقة في القرار في محور س ص. بالإضافة إلى ذلك، على النظام STED المتاحة تجاريا تستخدم لهذه التجارب، واستخدام سرعة عالية (12،000 هرتز) الماسح الضوئي صدى يسمح لسرعة اقتناء الصور مع الحد الأدنى من الضرر لعينات. وتعتبر مرونة محدودة في اختيار صبغة وضع غير مؤات من STED 12،ولكن اللون المزدوج STED واضح ومباشر نسبيا مع العديد من fluorophores متاحة تجاريا. دمج STED مع المجهر متحد البؤر المسح الضوئي ليزر يسمح أيضا للتصوير متحد البؤر إضافية في تركيبة مع STED، وذلك في حين STED يقتصر على قناتين، وهياكل إضافية يمكن تصويرها في متحد البؤر مع قرار من حوالي 200 نانومتر (E. الصولجان، والملاحظات غير منشورة ). في حين وصفنا استخدام STED لتصوير الخلايا المناعية، يتم تطبيق هذه التكنولوجيا لمجموعة متنوعة من أنواع الخلايا، بما في ذلك الخلايا العصبية، وتصور مجموعة متنوعة من هياكل الخلية 23-26. يستخدم SIM نهجا مختلفا لتوليد صور محدودة subdiffraction. من خلال وضع تصور أنماط الإثارة الدورية المعروفة، ومن ثم يمكن الحصول على معلومات حول بنية مجهولة تجري دراستها التالية التحول الرياضية 27. هذا ينتج زيادة في القرار إلى ~ 100 نانومتر أفقيا 28،29. ميزة SIM هو أنه طو متوافق مع جميع الأصباغ متحد البؤر القياسية وتحقيقات، ولكن العيب هو أنه أبطأ بكثير للحصول على الصور وهذه تتطلب مطولة مرحلة ما بعد المعالجة 12. وهذا يحد أيضا استخدامه لتصوير الخلايا الحية. أخيرا، يمكن أن تتولد الصور فائقة الدقة من العشوائية الصور التحول من fluorophores. يتم استغلال هذا النهج في تنشيط الصورة توطين المجهري (النخيل) ومؤشر ستوكاستيك المجهر إعادة الإعمار البصرية (STORM). عن طريق المسح الضوئي لقطة كاميرا متعددة وتوطين الجزيئات تفعيلها بشكل عشوائي التي تحولت &quot;على&quot; و &quot;خارج&quot; مع مرور الوقت، يتم إنشاء الصور مع قرار 20-30 نانومتر من الأطر المتراكمة 30-32. المفاضلة لهذا القرار هو الوقت اللازم للحصول على الصور. نحن هنا تظهر، في التفاصيل، وبروتوكول لإعداد وتصوير عينات اللون المزدوج في STED. في هذا النظام، هو الإثارة مع نابض، الانضباطي، ضوء الليزر الأبيض. نظرا لطبيعةمن الإثارة شعاع نابض، يرصد الوقت النابضة الكشف ممكن، والمزيد من الزيادات القرار. بالإضافة إلى ذلك، تم تجهيز نظام مع الجادولينيوم الهجين (HYD) كشف، والتي هي أكثر حساسية من أنابيب مضخم التقليدية، وبالتالي السماح لانخفاض متطلبات الطاقة الليزر. يتم تطبيق شعاع استنزاف لSTED مستمر ويتم ضبطها إلى 592 نانومتر، والتي سوف تملي اختيار الأصباغ المتاحة لهما اللون STED. تركيبات الصبغة المستخدمة عادة تشمل عموما واحد منفعل من قبل 488 نانومتر (مثل اليكسا فلور 488، أوريغون الأخضر، DyLights الأخضر، أو كروميو 488) واحد منفعل من قبل 458 نانومتر (مثل البرتقال أو المحيط الهادئ الأفق V500). وهكذا، في حين كشف عن الأصباغ اثنين سيكون في نطاق مماثل (وكلاهما يمكن الوصول إليها بواسطة الليزر استنزاف)، سوف تحدث الإثارة مع أطوال موجية مختلفة. مع الانضباطي الأبيض ضوء الليزر والانضباطي للكشف عن، وتعظيم إشارة حين القضاء على التداخل الطيفي مصنوع من السهل إلى حد ما. على هذا النحو، كان لدينا نجاح جيدة مع combinatأيونات الأصباغ المتاحة تجاريا، مثل البرتقال والمحيط الهادئ اليكسا فلور 488 (المستخدمة هنا). تم تصميم بروتوكول لدينا نحو ويصف تقييم خلايا NK الإنسان الذي يمثل التركيز التاريخية من مختبرنا. نحن على وجه التحديد استخدام خط الخلية NK92 في هذا المثال لأن ذلك هو واحد ونحن قد طبقت بشكل منتظم في منطقتنا 21،33 العمل التجريبي.

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:602px;" width="602">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:230px;">#1.5 cover slips</td>
			<td style="width:222px;">VWR</td>
			<td style="width:150px;">48393-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">BD Cytofix/Cytoperm</td>
			<td style="width:222px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:150px;">554722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:222px;">Sigma</td>
			<td style="width:150px;">A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Cotton tipped applicator</td>
			<td style="width:222px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">S450941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Falcon centrifuge tubes (50 ml)</td>
			<td style="width:222px;">VWR</td>
			<td style="width:150px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Fetal calf serum (FCS) (500 mL)</td>
			<td style="width:222px;">Atlantic Biologicals</td>
			<td style="width:150px;">S11050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Goat anti-rabbit Pacific Orange</td>
			<td style="width:222px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:150px;">P31584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Laboratory tissue wipers</td>
			<td style="width:222px;">VWR</td>
			<td style="width:150px;">82003-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Nail polish</td>
			<td style="width:222px;">VWR</td>
			<td style="width:150px;">100491-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">NK-92 cells</td>
			<td style="width:222px;">ATCC</td>
			<td style="width:150px;">CRL-2407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Phalloidin Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:222px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:150px;">A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:222px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:150px;">14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Prolong anti-fade reagent</td>
			<td style="width:222px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:150px;">P7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Purified anti-CD18</td>
			<td style="width:222px;">Biolegend</td>
			<td style="width:150px;">301202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Purified anti-NKp30</td>
			<td style="width:222px;">Biolegend</td>
			<td style="width:150px;">325202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Purified anti-perforin</td>
			<td style="width:222px;">Biolegend</td>
			<td style="width:150px;">308102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">RPMI 1640 medium (500 mL)</td>
			<td style="width:222px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:150px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Saponin from Quillaja bark</td>
			<td style="width:222px;">Sigma</td>
			<td style="width:150px;">S4521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Super PAP pen</td>
			<td style="width:222px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:150px;">008899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:222px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:150px;">22142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:27px;">Material Name</td>
			<td style="height:27px;">Company</td>
			<td style="height:27px;">Catalogue Number</td>
			<td style="height:27px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:27px;">Huygens deconvolution software</td>
			<td style="height:27px;">SVI</td>
			<td style="height:27px;">Contact company</td>
			<td style="height:27px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:27px;">Leica SP8 TCS STED microscope</td>
			<td style="height:27px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="height:27px;">Contact company</td>
			<td style="height:27px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (sted) nanoscopy

الخلايا القاتلة الطبيعية تشكل ينظم بإحكام، المشابك المناعية دقيقا (IS) من أجل ليز الخلايا المصابة فيروسي أو مكون للأورام. ديناميكية الأكتين إعادة تنظيم أمر بالغ الأهمية لوظيفة الخلايا القاتلة الطبيعية وتشكيل IS. التصوير من F-الأكتين في المشبك وقد استخدمت تقليديا المجهري متحد البؤر، ولكن الحد حيود الضوء يقيد حل مضان المجهري، بما في ذلك متحد البؤر، إلى ما يقرب من 200 نانومتر. وقد مكنت التطورات الحديثة في تكنولوجيا التصوير تطوير subdiffraction محدودة فائقة التصوير القرار. من أجل تصور العمارة F-الأكتين في IS نحن ألخص NK السامة للخلايا خلية المشبك من خلال الالتزام خلايا NK لتفعيل مستقبلات على الزجاج. نحن ثم البروتينات صورة ذات الاهتمام باستخدام اللونين استنزاف الانبعاث المستحث المجهري (STED). هذه النتائج في &lt;80 نانومتر قرار في المشبك. هنا نحن تصف خطوات إعداد العينات والحصول على الصور باستخدام عمود مزدوجأو STED nanoscopy لتصور F-الأكتين في NK IS. نحن أيضا توضيح الأمثل من اقتناء العينة باستخدام برامج لايكا SP8 وSTED بوابات الوقت. أخيرا، ونحن الاستفادة هيغنز برامج لمرحلة ما بعد المعالجة deconvolution من الصور.

بشكل واضح، فإن الهدف الأساسي من القرار فائقة التصوير يكون تحسنا متحد البؤر المجهري التقليدية. ومع ذلك، هناك بعض المخاطر المشتركة التي قد تؤدي إلى القرار الأمثل. هذه تتطلب أن يكون الأمثل لكل تجربة على حدة. في التجربة ممثل دينا، ونحن تصوير شبكة F-الأكتين في الخلايا القاتلة الطبيعية تفعيلها من خلال الأجسام المضادة بد أن الزجاج. الأسباب الشائعة ل(وتصحيحات ل) عدم وجود تحسن على قرار من STED متحد البؤر هي كما يلي: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت أخذ العينات (الشكل 1A). قد يؤدي هذا إلى التحبب وفقدان المعلومات بكسل، كما هو مبين في القرار الفقراء من خيوط F-الأكتين. زيادة خط أو الإطار المتوسط ​​في كثير من الأحيان يمكن تصحيح هذا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبيض و / أو الإفراط في أخذ العينات (الشكل 1B). قد يكون ذلك بسبب مطولة بكسل مدة بقاء نتيجة لخط المتوسط ​​المفرطة. بدلا من ذلك، قد يكون نتيجة الإفراط في المسح الضوئي للصورة قبل الاستحواذ، بما في ذلك الإفراط في استخدامالليزر نضوب. هذه النتائج عادة في الصور ضبابية أو غامض. هذا يمكن تصحيحه عن طريق المسح الضوئي مجال الاهتمام بالحد الأدنى فقط قبل الحصول أو، إذا كان ذلك ممكنا، وزيادة سرعة المسح الضوئي ليزر. إذا استمرت المشكلة، يمكن تخفيض قوة الليزر نضوب. </li></ol> من خلال تحقيق التوازن الصحيح من الوقت يسكن بكسل، الإثارة قوة الليزر، واستنزاف قوة الليزر، صورة مع تحسن القرار ومعلومات كافية يمكن أن تتولد (الشكل 1C). القرار يمكن تحسينها عن طريق استخدام deconvolution (الشكل 1D). عندما تم تحسين الاستحواذ، سوف deconvolution تحسين القرار كما ونوعا، وينبغي أن تكون شبه قرار 100 نانومتر يمكن بلوغه بصورة روتينية. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51100/51100fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51100/51100fig1.jpg" /> تم تفعيل الرقم 1. الأمثل لاقتناء والمخاطر المشتركة من التصوير STED. NK92 الخلايا على مكافحة CD18 وNKp30 الزجاج المطلي لمدة 20 دقيقة ثم ثابتة، permeabilized والملون لF-الأكتين مع Phalloidin اليكسا فلور 488. أ) مثال فقدان معلومات الصورة بسبب نقص أخذ العينات. ب) مثال على فقدان القرار بسبب تبيض / الإفراط في أخذ العينات ج) الظروف الأمثل د) الظروف الأمثل يؤدي إلى مزيد من التحسن في القرار مع deconvolution. شريط النطاق = 5 ميكرون.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy at JoVE.com

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy

نحن هنا توضيح بروتوكول للتصوير من قبل اثنين من الألوان STED nanoscopy والسامة للخلايا المشبك المناعي للخلايا NK لخص على الزجاج. باستخدام هذه الطريقة نحصل على شبه قرار 100 نيوتن متر من البروتينات المشبك والهيكل الخلوي.

تصور من قبل المناعية المشبك المزدوج اللون التوقيت بوابات-الانبعاث المستحث استنفاد (STED) Nanoscopy

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic ...

visualization-immunological-synapse-dual-color-time-gated-stimulated

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy

77.9K Views.  Texas Children's Hospital and Baylor College of Medicine.  نحن هنا توضيح بروتوكول للتصوير من قبل اثنين من الألوان STED nanoscopy والسامة للخلايا المشبك المناعي للخلايا NK لخص على الزجاج. باستخدام هذه الطريقة نحصل على شبه قرار 100 نيوتن متر من البروتينات المشبك والهيكل الخلوي. 

Video: Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions. In particular, molecular approaches such as real-time PCR and microarray analysis require the isolation of cell populations with high purity. Commonly used purification strategies include fluorescent activated cell sorting (FACS), magnetic bead separation and complement depletion. Of the three strategies, complement depletion offers the advantages of being fast, inexpensive, gentle on the cells and a high cell yield. The complement system is composed of a large number of plasma proteins that when activated initiate a proteolytic cascade culminating in the formation of a membrane-attack complex that forms a pore on a cell surface resulting in cell death1. The classical pathway is activated by IgM and IgG antibodies and was first described as a mechanism for killing bacteria. With the generation of monoclonal antibodies (mAb), the complement cascade can be used to lyse any cell population in an antigen-specific manner. Depletion of cells by the complement cascade is achieved by the addition of complement fixing antigen-specific antibodies and rabbit complement to the starting cell population. The cells are incubated for one hour at 37&deg;C and the lysed cells are subsequently removed by two rounds of washing. MAb with a high efficiency for complement fixation typically deplete 95-100% of the targeted cell population. Depending on the purification strategy for the targeted cell population, complement depletion can be used for cell purification or for the enrichment of cell populations that then can be further purified by a subsequent method.

To effectively study the function of immune cell populations their purification is often required. Complement depletion is a fast and inexpensive technique for the isolation of immune cell populations with high purity.

نضوب بالسكان خلية معينة من قبل استنفاد تكملة

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Facilitating the Analysis of Immunological Data with Visual Analytic Techniques

Visual analytics (VA) has emerged as a new way to analyze large dataset through interactive visual display. We demonstrated the utility and the flexibility of a VA approach in the analysis of biological datasets. Examples of these datasets in immunology include flow cytometry, Luminex data, and genotyping (e.g., single nucleotide polymorphism) data. Contrary to the traditional information visualization approach, VA restores the analysis power in the hands of analyst by allowing the analyst to engage in real-time data exploration process. We selected the VA software called Tableau after evaluating several VA tools. Two types of analysis tasks analysis within and between datasets were demonstrated in the video presentation using an approach called paired analysis. Paired analysis, as defined in VA, is an analysis approach in which a VA tool expert works side-by-side with a domain expert during the analysis. The domain expert is the one who understands the significance of the data, and asks the questions that the collected data might address. The tool expert then creates visualizations to help find patterns in the data that might answer these questions. The short lag-time between the hypothesis generation and the rapid visual display of the data is the main advantage of a VA approach.

Visual analytics (VA) is a new approach of analyzing data interactively. In this video, we discuss the data overload problem brought on by high-throughput biological experiments, and propose VA as a solution to such problem. The video demonstrates analysis within and between immunological datasets using a VA tool called Tableau.

تيسير تحليل البيانات مناعية مع التقنيات التحليلية البصرية

Visual analytics (VA) has emerged as a new way to analyze large dataset through interactive visual display. We demonstrated the utility and the ...

Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Macrophages are critical players in the innate immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune response and directing the acquired immune response. Macrophage dysfunction can lead to an inability to mount an appropriate immune response and as such, has been implicated in many disease processes, including inflammatory bowel diseases. Macrophages display polarized phenotypes that are broadly divided into two categories. Classically activated macrophages, activated by stimulation with IFN&gamma; or LPS, play an essential role in response to bacterial challenge whereas alternatively activated macrophages, activated by IL-4 or IL-13, participate in debris scavenging and tissue remodeling and have been implicated in the resolution phase of inflammation. During an inflammatory response in vivo, macrophages are found amid a complex mixture of infiltrating immune cells and may participate by exacerbating or resolving inflammation. To define the role of macrophages in situ in a whole animal model, it is necessary to examine the effect of depleting macrophages from the complex environment. To ask questions about the role of macrophage phenotype in situ, phenotypically defined polarized macrophages can be derived ex vivo, from bone marrow aspirates and added back to mice, with or without prior depletion of macrophages. In the protocol presented here clodronate-containing liposomes, versus PBS injected controls, were used to deplete colonic macrophages during dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis in mice. In addition, polarized macrophages were derived ex vivo and transferred to mice by intravenous injection. A caveat to this approach is that clodronate-containing liposomes deplete all professional phagocytes, including both dendritic cells and macrophages so to ensure the effect observed by depletion is macrophage-specific, reconstitution of phenotype by adoptive transfer of macrophages is necessary. Systemic macrophage depletion in mice can also be achieved by backcrossing mice onto a CD11b-DTR background, which is an excellent complementary approach. The advantage of clodronate-containing liposome-mediated depletion is that it does not require the time and expense involved in backcrossing mice and it can be used in mice regardless of the background of the mice (C57BL/6, BALB/c, or mixed background).

Macrophages play a central role in homeostasis and pathology in many tissues. The protocol presented here describes methods for depleting macrophages in vivo, deriving polarized macrophages from bone marrow aspirates, and adoptively transferring macrophages into mice. These techniques allow determination of the role that polarized macrophages play in health and disease.

نضوب وإعادة إعماره الضامة في الفئران

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

بلعم الكولسترول استنفاد وتأثيره على البلعمة من<em&gt; المستخفية المورمة</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has been in the study of immunological synapse formation, due to the ability of the glass-supported planar lipid bilayers to mimic the surface of a target cell while forming a horizontal interface. The recent advances in super-resolution imaging have further allowed scientists to better view the fine details of synapse structure. In this study, one of these advanced techniques, stimulated emission depletion (STED), is utilized to study the structure of natural killer (NK) cell synapses on the supported lipid bilayer. Provided herein is an easy-to-follow protocol detailing: how to prepare raw synthetic phospholipids for use in synthesizing glass-supported bilayers; how to determine how densely protein of a given concentration occupies the bilayer's attachment sites; how to construct a supported lipid bilayer containing antibodies against NK cell activating receptor CD16; and finally, how to image human NK cells on this bilayer using STED super-resolution microscopy, with a focus on distribution of perforin positive lytic granules and filamentous actin at NK synapses. Thus, combining the glass-supported planar lipid bilayer system with STED technique, we demonstrate the feasibility and application of this combined technique, as well as intracellular structures at NK immunological synapse with super-resolution.

We describe here a combination of the glass-supported lipid bilayer technique of forming immunological synapses with the super-resolution imaging technique of stimulated emission depletion (STED) microscopy. The goal of this protocol is to provide users with the instructions necessary to successfully carry out these two techniques.

فائقة الدقة التصوير من الخلايا القاتلة الطبيعية المناعية المشبك على دعم الزجاج مستو الدهن طبقة ثنائية

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological synapses&#39;. Within these intimate cell-cell interfaces discrete sub-cellular clusters of MHC/Ag-TCR, F-actin, adhesion and signaling molecules form and remodel rapidly. These dynamics are thought to be critical determinants of both the efficiency and quality of the immune responses that develop and therefore of protective versus pathologic immunity. Current understanding of immunological synapses with physiologic APCs is limited by the inadequacy of the obtainable imaging resolution. Though artificial substrate models (e.g., planar lipid bilayers) offer excellent resolution and have been extremely valuable tools, they are inherently non-physiologic and oversimplified. Vascular and lymphatic endothelial cells have emerged as an important peripheral tissue (or stromal) compartment of &#39;semi-professional APCs&#39;. These APCs (which express most of the molecular machinery of professional APCs) have the unique feature of forming virtually planar cell surface and are readily transfectable (e.g., with fluorescent protein reporters). Herein a basic approach to implement endothelial cells as a novel and physiologic &#39;planar cellular APC model&#39; for improved imaging and interrogation of fundamental antigenic signaling processes will be described.

Adaptive immunity is controlled by dynamic 'immunological synapses' formed between T cells and antigen presenting cells. This protocol describes methods for investigating endothelial cells both as understudied physiologic APCs and as a novel type of 'planar cellular APC model'.

نموذج الخلايا البطانية مستو التصوير المناعية سنبس حيوية

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins towards the immune synapse to assure a stable binding and signal exchange. Classical confocal, TIRF, or super-resolution microscopy have been used to study the immune synapse. Since these methods require manual image acquisition and time-consuming quantification, the imaging of rare events is challenging. Here, we describe a workflow that enables the morphological analysis of tens of thousands of cells. Immune synapses are induced between primary human T cells in pan-leukocyte preparations and Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB)-loaded Raji cells as APCs. Image acquisition is performed with imaging flow cytometry, also called In-Flow microscopy, which combines features of a flow cytometer and a fluorescence microscope. A complete gating strategy for identifying T cell/APC couples and analyzing the immune synapses is provided. As this workflow allows the analysis of immune synapses in unpurified pan-leukocyte preparations and hence requires only a small volume of blood (i.e., 1 mL), it can be applied to samples from patients. Importantly, several samples can be prepared, measured, and analyzed in parallel.

Here, we describe a complete workflow for the qualitative and quantitative analysis of immune synapses between primary human T cells and antigen-presenting cells. The method is based on imaging flow cytometry, which allows the acquisition and evaluation of several thousand cell images within a relatively short period of time.

تحليل نوعي وكمي المشبك محصنة في النظام البشري باستخدام التصوير التدفق الخلوي

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy

B cells that bind to membrane-bound antigens (e.g., on the surface of an antigen-presenting cell) form an immune synapse, a specialized cellular structure that optimizes B-cell receptor (BCR) signaling and BCR-mediated antigen acquisition. Both the remodeling of the actin cytoskeleton and the reorientation of the microtubule network towards the antigen contact site are essential for immune synapse formation. Remodeling of the actin cytoskeleton into a dense peripheral ring of F-actin is accompanied by polarization of the microtubule-organizing center towards the immune synapse. Microtubule plus-end binding proteins, as well as cortical plus-end capture proteins mediate physical interactions between the actin and microtubule cytoskeletons, which allow them to be reorganized in a coordinated manner. Elucidating the mechanisms that control this cytoskeletal reorganization, as well as understanding how these cytoskeletal structures shape immune synapse formation and BCR signaling, can provide new insights into B cell activation. This has been aided by the development of super-resolution microscopy approaches that reveal new details of cytoskeletal network organization. We describe here a method for using stimulated emission depletion (STED) microscopy to simultaneously image actin structures, microtubules, and transfected GFP-tagged microtubule plus-end binding proteins in B cells. To model the early events in immune synapse formation, we allow B cells to spread on coverslips coated with anti-immunoglobulin (anti-Ig) antibodies, which initiate BCR signaling and cytoskeleton remodeling. We provide step-by-step protocols for expressing GFP fusion proteins in A20 B-lymphoma cells, for anti-Ig-induced cell spreading, and for subsequent cell fixation, Immunostaining, image acquisition, and image deconvolution steps. The high-resolution images obtained using these procedures allow one to simultaneously visualize actin structures, microtubules, and the microtubule plus-end binding proteins that may link these two cytoskeletal networks.

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion STED Microscopy

We present a protocol for using STED microscopy to simultaneously image actin structures, microtubules, and microtubule plus-end binding proteins in B cells that have spread on coverslips coated with antibodies to the B-cell receptor, a model for the initial phase of immune synapse formation.

تصور أكتين وسيتوسكيليتونس ميكروتوبولي في المشبك محصنة خلية ب استخدام الفحص المجهري استنفاد (STED) حفز الانبعاثات

B cells that bind to membrane-bound antigens (e.g., on the surface of an antigen-presenting cell) form an immune synapse, a specialized cellular structure ...

Studying Organelle Dynamics in B Cells During Immune Synapse Formation

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both signaling&#160;and antigen uptake are coordinated. IS formation involves dynamic actin remodeling accompanied by the polarized recruitment to the synaptic membrane of the centrosome and associated intracellular organelles such as lysosomes and the Golgi apparatus. Initial stages of actin remodeling allow B cells to increase their cell surface and maximize the quantity of antigen-BCR complexes gathered at the synapse. Under certain conditions, when B cells recognize antigens associated to rigid surfaces, this process is coupled to the local recruitment and secretion of lysosomes, which can facilitate antigen extraction. Uptaken antigens&#160;are internalized into specialized endo-lysosome compartments for processing into peptides, which are loaded onto major histocompatibility complex II (MHC-II) molecules for further presentation to T helper cells. Therefore, studying organelle dynamics associated with the formation of an IS is crucial to understanding how B cells are activated. In the present article we will discuss both imaging and a biochemical technique used to study changes in intracellular organelle positioning and cytoskeleton rearrangements that are associated with the formation of an IS in B cells.

Herein we describe two approaches to characterize cell polarization events in B lymphocytes during the formation of an IS. The first, involves quantification of organelle recruitment and cytoskeleton rearrangements at the synaptic membrane. The second is a biochemical approach, to characterize changes in composition of the centrosome, which undergoes polarization to the immune synapse.

دراسة ديناميات الأعضاء في الخلايا B أثناء تكوين المشبك المناعي

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both ...

Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics (DCAF)

Elimination of harmful antibodies from organisms is a valuable approach for the intervention of antibody-associated diseases, such as Dengue hemorrhagic fever and autoimmune diseases. Since thousands of antibodies with different epitopes are circulating in blood, no universal method, except for the dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF), was reported to target specific harmful antibodies. The development of DCAF molecules makes significant contribution to the progress of targeted therapy, which were demonstrated to eliminate the antibody dependent enhancement (ADE) effect in a Dengue virus (DENV) infection model and to boost the acetylcholine receptor activity in a myasthenia gravis model. Here, we describe a protocol for the synthesis of a DCAF molecule (DCAF1), which can selectively block 4G2 antibody to attenuate ADE effect during Dengue virus infection, and illustrate the binding of DCAF1 to 4G2 antibody by an ELISA assay. In our method, DCAF1 is synthesized by the conjugation of a hydrazine derivative of a Fc-III peptide and a recombinant expressed long &#945;-helix with antigenic sequence through native chemical ligation (NCL). This protocol has been successfully applied to DCAF1 as well as other DCAF molecules for targeting their cognate antibodies.

Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics DCAF

Development of a dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF) is novel for the elimination of harmful antibodies. Here, we describe a detailed protocol for the synthesis of DCAF1 molecule, which can selectively block 4G2 antibody to eliminate antibody dependent enhancement effect during Dengue virus infection.

حجب الأجسام المضادة المستهدفة بواسطة متقارن مزدوج الوظائف من الببتيد المضاد للجينات وFc-III Mimetics (DCAF)

Elimination of harmful antibodies from organisms is a valuable approach for the intervention of antibody-associated diseases, such as Dengue hemorrhagic ...