نحن نقدم طريقة لإنشاء الثقافة العضوية لظهارة مجرى الهواء البشري في لوحات الثقافة. نحن نستمد عضوي الرئة البشرية مباشرة من أنسجة الرئة الأولية بكفاءة عالية. يتم توسيع عضوي الرئة البشري المشتق بشكل ثابت لأكثر من عام واحد ، ويسمح بروتوكول التمايز القريب بتوليد عضويات مجرى الهواء الناضجة التي يمكنها محاكاة ظهارة مجرى الهواء البشري بأمانة إلى مستوى فسيولوجي قريب.
لذلك ، يسمح نظام الاستزراع للعلماء بإعادة بناء وتوسيع ظهارة مجرى الهواء البشري في ألواح الثقافة. إظهار الإجراء سيكون مان تشون تشيو وييفي يو ، طلاب الدكتوراه في مختبرنا لبدء عزل الخلايا من أنسجة الرئة البشرية للثقافة العضوية 3D ، وقطع أنسجة الرئة إلى قطع صغيرة ملليمتر واحد مع مشرط معقم وغسل قطع الأنسجة مع 10 ملليلتر من الوسط القاعدي البارد. الطرد المركزي للأنسجة في 400 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية والتخلص من supernatant قبل تعليق الكريات في ثمانية ملليلتر من الوسط القاعدي المكمل بالكولاجيناز بتركيز نهائي قدره ملليغرام لكل ملليلتر.
ثم ، هضم قطع الأنسجة عن طريق هز الأنبوب عند 120 دورة في الدقيقة لمدة 30 إلى 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد الهضم ، ماصة لأعلى ولأسفل 20 مرة باستخدام ماصة مصلية 10 ملليلتر لقص قطع الأنسجة المهضومة. ثم قم بتصفية التعليق باستخدام مصفاة 100 ميكرون في أنبوب سعة 50 ملليلتر.
استعادة ونقل قطع الأنسجة من المصفاة إلى أنبوب طرد مركزي 15 ملليلتر مع الوسط القاعدي. لإنهاء عملية الهضم ، أضف مصل البقر الجنيني إلى التدفق إلى تركيز نهائي قدره 2٪ ثم ، قم بالطرد المركزي للأنبوب وأعد تعليق حبيبات الخلية في 10 ملليلتر من الوسط القاعدي كما هو موضح من قبل. بعد الطرد المركزي ، أعد تعليق الكريات في 80 إلى 160 ميكرولتر من وسط مصفوفة الطابق السفلي البارد ووضع الأنابيب على الجليد.
بعد ذلك ، قم بتوزيع 40 ميكرولتر من التعليق على كل بئر من لوحة ثقافة التعليق 24 بئرا التي تم تسخينها مسبقا. احتضن الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة 10 إلى 15 دقيقة. اسمح لمصفوفة الطابق السفلي بالتصلب وتشكيل قطرة.
بعد الحضانة ، أضف 500 ميكرولتر من وسط توسع عضويات الرئة البشرية مع خمسة نانومولات من heregulin-beta 1 إلى كل بئر واحتضن اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا. بعد ثلاثة أيام ، قم بإزالة الوسط القديم مع الحفاظ على القطرة سليمة وأضف الوسط الطازج بعناية. بعد 10 إلى 14 يوما من المرور ، راقب المواد العضوية تحت المجهر وتأكد من عدم تضمين المواد العضوية بكثافة خلايا عالية جدا.
لتمرير المواد العضوية الرئوية مع القص ، قم بكسر القطرات عن طريق السحب لأعلى ولأسفل بطرف ملليلتر واحد. ثم ، انقل المواد العضوية مع الوسط إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر واضبط الحجم إلى 10 ملليلتر باستخدام وسط قاعدي بارد. قم بالطرد المركزي للأنبوب بسرعة 300 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية ، وتخلص من السوبرناتانت ، واغسل المواد العضوية ب 10 ملليلتر من الوسط القاعدي البارد.
ثم ، أعد تعليق المواد العضوية في ملليلترين من الوسط القاعدي البارد وقصها إلى قطع صغيرة باستخدام ماصة باستور. بعد ذلك ، أضف الوسط القاعدي إلى حجم إجمالي قدره 10 ملليلتر وأجهزة طرد مركزي قبل إعادة تعليق الشظايا العضوية بمصفوفة قبو باردة كافية لتمكين التوسع من 1: 3 إلى 1: 5 ووضع الأنابيب على الجليد. قم بتوزيع 40 ميكرولتر من التعليق العضوي في كل بئر من صفيحة 24 بئرا تم تسخينها مسبقا للاحتضان عند 37 درجة مئوية للسماح لمصفوفة الطابق السفلي بالتصلب لمدة 10 إلى 15 دقيقة.
في وقت لاحق ، أضف 500 ميكرولتر من وسط توسع الرئة العضوي إلى كل بئر واحتضنها في حاضنة زراعة الخلايا. تحديث الوسط كل ثلاثة أيام وتمرير المواد العضوية كل أسبوعين. لتمرير عضويات الرئة مع التربسينات ، أعد تعليق عضويات الرئة التي تم حصادها في ملليلتر واحد من إنزيم التفكك.
احتضن العضو العضوي في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة ثلاث إلى خمس دقائق. ثم ، أضف ملليلتر واحد من الوسط القاعدي إلى الأنبوب وقص المواد العضوية ميكانيكيا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. تحقق من حجم القطع العضوية تحت المجهر عند تكبير 100X قبل إنهاء عملية الهضم باستخدام 40 ميكرولتر من مصل البقر الجنيني.
قم بتكوين الحجم إلى 10 ملليلتر باستخدام الوسط القاعدي وأجهزة الطرد المركزي قبل إعادة تعليق القطع العضوية في مصفوفة قبو باردة بحجم يكفي للمرور بنسبة 1: 5 إلى 1: 10. في وقت لاحق ، قم بتوزيع 40 ميكرولتر من التعليق العضوي في كل بئر من صفيحة 24 بئرا وقم بزراعة اللوحة كما هو موضح من قبل. لتوليد 3D الهواء العضوية، احتضان العضوية الرئة في وسط التوسع لمدة سبعة إلى 10 أيام بعد المرور عن طريق القص الميكانيكي.
ثم ، استبدل وسط التمدد بوسط تمايز قريب واحتضن المواد العضوية في حاضنة زراعة الخلايا. بعد 14 يوما ، تخلص من الوسط في كل بئر وأضف المخزن المؤقت للخلية لحصاد المجرى الهوائي العضوي المتمايز لاستخراج الحمض النووي الريبي والكشف عن التعبير الجيني الخلوي بواسطة فحص RT-qPCR. قبل احتضان الإدخالات في حاضنة زراعة الخلايا مع 250 و 500 ميكرولتر من الوسط القاعدي في الغرفة العلوية والسفلية للوحة 24 بئرا ، على التوالي.
ثم ، أضف ملليلتر واحد من الوسط القاعدي إلى الأنبوب وماصة لأعلى ولأسفل لقص المواد العضوية في خلايا مفردة. راقب الخلايا تحت المجهر قبل إنهاء عملية الهضم باستخدام 40 ميكرولتر من مصل البقر الجنيني. قم بتصفية الخلايا من خلال مصفاة 40 ميكرون إلى أنبوب سعة 50 ملليلتر ونقل تعليق الخلية المصفى إلى أنبوب 15 ملليلتر.
قم بتعبئة التعليق بوسط قاعدي إلى حجم إجمالي يبلغ 10 ملليلتر. بعد الطرد المركزي ، أعد تعليق الكريات التي تم جمعها من 24 قطرة في 1 إلى 2.5 ملليلتر من وسط تمدد الرئة العضوي ، اعتمادا على كثافة الخلية. احسب عدد الخلايا التي تحتوي على عداد الخلايا تحت المجهر ، ثم اضبط تركيز الخلية على 1.3 في 10 إلى ستة لكل ملليلتر لإدراج 24 بئرا.
قم بإزالة الوسط القاعدي من الغرف العلوية والسفلية قبل إضافة 500 ميكرولتر من وسط التمدد في الغرفة السفلية. بذور 100 ميكرولتر من تعليق الخلايا أعدت في وقت سابق على الغرفة القمية من إدراج 24 بئرا واحتضانها. بعد يومين ، استبدل وسط التمدد بوسط تمايز قريب في كل من الغرفة القمية والسفلية للوحة.
احتضن المواد العضوية لمدة 14 يوما وقم بتحديث الوسط كل ثلاثة أيام. قم بقياس المقاومة الكهربائية عبر الظهارة كل يوم باستخدام نظام قياس المقاومة الكهربائية. في الصورة الميكروفوتوغرافية التمثيلية ، يمكن رؤية خلايا الرئة المعزولة حديثا مضمنة في مصفوفة الغشاء السفلي لعامل النمو المنخفض من النوع الثاني.
ظهرت المواد العضوية الكيسية ونمت مع مرور الوقت. يتم عرض عضويات الرئة بعد المقطع الرابع هنا. في غضون ساعتين من القص الميكانيكي ، شكلت الشظايا العضوية المضمنة في مستخلص الغشاء السفلي المجالات الكيسية.
أكدت الصورة الدقيقة لنفس الحقل في اليوم الخامس نمو العضوية بمرور الوقت. كانت الخلايا العضوية المتوسعة تؤوي جميع أنواع الخلايا الظهارية الرئيسية الأربعة في مجرى الهواء ، بما في ذلك الخلايا الهدبية الإيجابية ACCTUB أو FOXJ1 الإيجابية ، والخلية القاعدية الإيجابية P63 ، وخلية النادي الإيجابية CC10 ، وخلية الكأس الإيجابية MUC5AC في حالة سابقة لأوانها. طورت المواد العضوية المحتضنة في وسط التمايز التوسعي والتمايز القريب مورفولوجيا متميزة بمرور الوقت.
بعد أسبوعين من التمايز في وسط التمايز القريب ، كانت الأهداب المتحركة ملحوظة في كل عضوي. ولوحظ أن الاضطرابات الهضمية الضرب بشكل متزامن دفعت حطام الخلية داخل التجويف العضوي ودارت بها في اتجاه واحد لإزالة الجسيمات المستنشقة. علاوة على ذلك ، أظهر تحليل قياس التدفق الخلوي أن المواد العضوية المتباينة تستوعب أربعة أنواع من الخلايا الظهارية في مجرى الهواء في التمايز القريب ووسط التمدد.
بعد أسبوعين من التمايز ، طورت عضويات مجرى الهواء 2D حاجزا ظهاريا سليما. تم إجراء فحص انسداد ديكستران لتقييم سلامة الحاجز الظهاري المتشكل في عضويات مجرى الهواء 2D. تحتوي المواد العضوية 2D على خلايا هدبية وفيرة.
يوفر الجهاز العضوي الرئوي القابل للتوسيع على المدى الطويل والجهاز العضوي المتمايز في مجرى الهواء نظاما نموذجيا نشطا من الناحية الفسيولوجية وعالميا لدراسة بيولوجيا الجهاز التنفسي وعلم الأمراض ، بما في ذلك COVID-19.
