تفتقر النماذج المستخدمة سابقا في المختبر أو خارج الجسم الحي إلى مكونات الخلايا الجلدية وتعقيد أنسجة الجلد. يتغلب اختبار SCAD خارج الموقع الطبيعي على قيود محددة ويتيح دراسة تطور الندوب خارج الحيوان المصاب. يسمح فحص SCAD بتصور هجرة الخلايا الليفية وتكوين الندبات في البيئات الدقيقة للجلد.
وهي تمكن مكتبات فحص المنشطات أو المثبطات من فهم الأساس الميكانيكي لتشكيل الندوب. فحوصات فحص عالية الإنتاجية للمكتبات المسطحة باستخدام نموذج SCAD في فهم العملية الأساسية ومسار الجزيء المتضمن في إصلاح الجروح. من السهل إجراء فحص SCAD باستخدام الجلد الظاهر.
للحصول على ندبة ثابتة، يوصى باختيار بشرة اليوم صفر أو اليوم الأول بعد الولادة. بعد التضحية بجرو حديثي الولادة بعد يوم الصفر أو اليوم الأول ، استخدمي مشرطا جراحيا معقما لاستئصال الجلد الظهري الظهري الكامل السماكة 1.5 × 1.5 سم بعناية حتى طبقة العضلات الهيكلية. قشر الجلد باستخدام ملقط منحني معقم ، مما يضمن أن اللفافة السطحية سليمة مع عضلة البانيكولوس الكارنوسوس الكامنة.
اغسل الأنسجة المستأصلة ب 50 إلى 100 ملليلتر من وسط DMEM F-12 البارد لإزالة الدم الملوث. ثم اغسل الأنسجة بمحلول الملح المتوازن Hanks للحفاظ على بقاء الأنسجة والخلايا. ضع الجلد رأسا على عقب مع لفافة سطحية في الأعلى في طبق بتري بطول 10 سم يحتوي على وسط DMEM F-12.
ثم، باستخدام لكمة خزعة يمكن التخلص منها بمليمترين، قم باستئصال قطع الجلد المستديرة كاملة السماكة لتوليد أنسجة جربية، مما يضمن أن اللفافة السطحية سليمة مع عضلة البانيكولوس الكارنوسية الكامنة حتى البشرة. أضف 200 ميكرولتر من DMEM F-12 الطازج وسط كامل بدون أحمر الفينول في كل بئر من صفيحة 96 بئرا. باستخدام ملقط معقم ، قم بنقل الأنسجة الفردية المجعدة وغمرها بالكامل رأسا على عقب إلى آبار صفيحة 96 بئرا.
انقل اللوحة إلى حاضنة زراعة الخلايا التي يتم الحفاظ عليها في ظل ظروف قياسية. في اليومين الثاني والرابع من الثقافة، قم بإزالة الوسط تاركا 10 ميكرولترات في البئر وأضف وسيطا كاملا جديدا من DMEM F-12 تم تسخينه مسبقا إلى جانب مركبات العلاج للحفاظ على استمرار ظروف بقاء الخلايا والأنسجة. للتصوير الحي ل SCADs ، قم بإعداد 30 ملليلتر من محلول الأغاروز منخفض الذوبان بنسبة 2 إلى 3٪ في PBS في زجاجة زجاجية عن طريق التسخين في الميكروويف.
بعد الغليان ، انقل الزجاجة على الفور وقم بتبريد محلول الأغاروز السائل في حمام مائي 40 درجة مئوية. بعد ذلك ، انقل أنسجة SCAD مع لفافة أو ندبة متجهة لأعلى إلى وسط طبق 35 ملم. ثم قم بتضمين SCAD في درجة حرارة الغرفة عن طريق سكب الأغاروز السائل 40 درجة مئوية ببطء على الأنسجة باستخدام طرف ماصة سعة 1000 ميكرولتر.
يتبلمر Agarose في غضون دقيقتين. بعد البلمرة ، أضف ملليلتر من المتوسط الكامل DMEM F-12 المسخن مسبقا. ثم باستخدام مجهر متحد البؤرة أو متعدد الفوتونات مجهز بأنظمة حضانة مناسبة موضحة في المخطوطة ، احصل على صور بفاصل زمني من اليوم صفر إلى اليوم الأول.
لحصاد الأنسجة ، اغسل الأنسجة في النقاط الزمنية ذات الصلة عن طريق استبدال الوسائط ب PBS معقمة. باستخدام ملقط معقم ، انقل كل SCAD إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر يحتوي على 500 ميكرولتر من 2٪ paraformaldehyde لإصلاح الأنسجة بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، اغسل الأنسجة ثلاث مرات باستخدام PBS قبل الانتقال إلى تلطيخ التألق المناعي ثنائي أو ثلاثي الأبعاد كما هو موضح في مخطوطة النص.
يتم عرض صور الحقول الساطعة التمثيلية الكاملة ل SCADs في اليومين صفر وخمسة هنا. يكشف تلطيخ ماسون ثلاثي الألوان لأقسام الأنسجة الرأسية عن بصمات تندب الأنسجة وتقلص الأنسجة وتراكم المصفوفة خارج الخلية في قلب الندبة في اليومين صفر وخامسة. يتم عرض تلطيخ التألق المناعي ل SCADs في اليومين صفر و 5.
من ندبة المرحلة المبكرة والمتأخرة ، تظهر الخلايا الليفية الإيجابية المتأصلة باللون الأخضر والخلايا الليفية السلبية المتأصلة باللون الأحمر. بالنسبة للتصوير ثلاثي الأبعاد ، تم تضمين الأنسجة في محلول الأغاروز وتعلوها PBSGT. توضح الصور التمثيلية التوطين الحصري لبروتين N-cadherin في موقع الندبة في اليوم الخامس من SCAD.
عرض إعداد التصوير ثلاثي الأبعاد للفاصل الزمني المجهز بغرفة حضانة الأحداث المبكرة لتطور أسراب الخلايا الليفية خلال ال 12 ساعة الأولى أو المراحل المبكرة من تطور الندبة. يتم عرض التمثيل الرسومي للمسارات الخلوية المتعقبة أحادية الخلية للخلايا الليفية الفردية على تطور الندبة هنا. من الأهمية بمكان وضع أنسجة SCAD رأسا على عقب داخل صفيحة البئر بحيث تواجه اللفافة لأعلى.
ومن شأن عدم القيام بذلك أن يؤدي إلى اختلافات لا مفر منها في أنماط الهجرة. يسمح هذا الإجراء بفحص طبقات الجلد للعلاجات أو الثقافة باستخدام المعدلات الكيميائية أو الأجسام المضادة المحايدة أو الطرق الفيروسية. هذا يساعد في تقييم الاستجابات الليفية المرضية عبر البيئات الطبية المتنوعة.
أظهرنا التعبير عن connexin-43 و N-cadherin كجزيئات رئيسية تشارك في تعبئة اللفافة عند الجرح. تسمح منهجية SCAD بتحديد استراتيجيات علاجية جديدة للحد من الندوب والتليف.
