في هذه المقالة، نقدم بروتوكولا محسنا لجرح الجلد البشري في الجسم الحي يمكن أن يوفر بيانات فعالية مهمة كجزء من خط أنابيب ترجمة سريري. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بتقييم دقيق عالي الإنتاجية لإصلاح الجروح في الجلد البشري الحي. وستبرهن على الإجراء إليزابيث روبرتس، باحثة ما بعد الدكتوراه، والإسكندرية كيد، وهي مساعدة باحثة من مختبرنا.
لإعداد عينة من أنسجة الجلد للجرح، ضع جانب الأدمة الجلدية لأسفل في طبق بيتري عيار 90 ملليمتر واستخدم مقصا معقما لإزالة الأنسجة الدهنية. عندما تتم إزالة جميع الدهون، ضع الجلد في 25 ملليلتر من HBSS تكملها المضادات الحيوية لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز متقطعة لإزالة أي دم المتبقية في الأنسجة الدهنية. بعد 10 دقائق، شطف الجلد في 25 ملليلتر من DPBS.
بعد 10 دقائق، كرر شطف HBSS دون مضادات حيوية، ثم قم بإجراء شطف نهائي في 25 ملليلتر من DPBS. ثم ضع غشاء فلتر نايلون معقم على كومة الوسادة الماصة وجفف الجانب الجلدي من الجلد على شاش معقم في طبق بيتري عيار 90 ملليمترا لإزالة DPBS المتبقية. وضع الجلد المجفف الأدمة الجانب إلى أسفل على غطاء طبق بيتري نظيفة 90 ملليمتر لإزالة أي DPBS المتبقية وداب البشرة الجافة مع الشاش العقيم الطازج.
لإنشاء جرح، اضغط على لكمة خزعة ملليمترين ضد الجلد مع الإمساك بالجلد بإحكام والتواء بلطف. باستخدام ملقط الأنسجة المسننة المنحنية، والتقاط كل جانب من الجرح قطرها ما يقرب من ملليمترين وربط مقص القزحية المنحني تحت الجرح. استخدام لكمة خزعة ستة ملليمتر لخزعة حول الجرح المركزي مليمترين لخلق explant ستة ملليمتر مع سمك جزئي جرح ملليمترين في المركز.
ثم ضع الجرح explant البشرة الجانب حتى على كومة غشاء مرشح النايلون لاحتضان لمدة يوم إلى سبعة أيام في 32 إلى 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. لتلطيخ الفلورسنت، وجمع explants الجرح في أنابيب الطرد الدقيق 1.5 ملليلتر تحتوي على 500 ميكرولتر من تثبيت الجلد لكل أنبوب واحتضان النباتات بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. في اليوم التالي، استبدل المثبت بميليلتر واحد من مخزن الغسيل المؤقت للتلطيخ.
بعد الغسيل، قم بتغطية كل عينة بما يقرب من 150 ميكرولتر من العازلة العازلة واحتضنها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد إزالة العازلة حجب، إضافة 150 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المخفف في حظر العازلة لكل أنبوب واحتضان explants الجرح بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. في صباح اليوم التالي، شطف العينات مع 500 ميكرولتر من تلطيخ غسل العازلة التي تحتوي على 0.2٪ azide الصوديوم تليها ثلاثة شطف في عازلة غسل العادية.
بعد الغسيل، أضف 150 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المناسبة المترافقة مع الفلورسينس المخففة في عازل غسل التلطيخ إلى كل بئر لاحتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، اشطف الشطف ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة في 500 ميكرولتر من مخزن الغسيل التلطيخي لكل غسل قبل إزالة تلطيخ كل سعة مع 150 ميكرولتر من DAPI لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. وأخيرا، اغسل الزرع مرتين لمدة 30 دقيقة مع 500 ميكرولتر من مخزن الغسيل المؤقت لكل غسلة.
للتصوير التجريبي، ضع طبق بيتري عيار 60 ملليمترا على منصة التصوير لمجهر كونفوجكال وأضف طبقة ملليلتر واحدة تقريبا من DPBS إلى الطبق. استخدام ملقط لنقل explants الجرح إلى الطبق. بعد إعداد برنامج التصوير حسب الاقتضاء للتجربة ، ضع الجرح في وسط مستوى التصوير والحصول على صور خزعات الجرح.
لإجراء التصوير بالمجهر الرقمي اللاسلكي للحصول على صور عالية الجودة بطريقة فعالة من حيث التكلفة، قم بتوصيل الهاتف أو الكمبيوتر المحمول بالمجهر الرقمي اللاسلكي. ضع جانب الجرح في النباتات السابقة على قطعة من أنسجة المختبر وأزل أي عازل غسيل متبقي من العينة. ثم ضع explant في وسط مجال الرؤية للمجهر والحصول على الصور باستخدام الكاميرا المتصلة.
يمكن استخدام Immunoperoxidase والمناعة لتلطيخ الأنسجة جبل كامل. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء تلطيخ حية / ميتة على الأنسجة الطازجة وصورت قبل أو بعد التثبيت. يمكن استخدام تلطيخ الجروح بالكامل لتحديد معدلات إغلاق الجرح بطريقة قابلة للاستنساخ.
في هذا التحليل التمثيلي، لوحظ إغلاق صحي لجروح الجلد بعد أربعة إلى خمسة أيام في حين فشلت جروح الجلد السكري في الإغلاق الكامل خلال فترة التحليل التي استمرت سبعة أيام. بلغ التعبير K14 ذروته في اليوم الثاني في جروح الجلد الصحية قبل أن ينخفض بسرعة مع زيادة التمايز البشرة. هذا إعادة الظهارة والتمايز البشرة اللاحقة تأخر في جروح الجلد السكري.
إصلاح حاجز البشرة المبكر يستبعد اختراق الأجسام المضادة K14 داخل طبقات البشرة المتمايزة. في وقت مبكر من عملية إعادة الظهارة ، K14 إيجابية keratinocytes طبقة القاعدية الهجرة إلى الداخل على الجرح المفتوح ، بحيث البشرة أقرب إلى حافة الجرح الخارجي أشكال في وقت سابق من البشرة أقرب إلى حافة الجرح الداخلي. في وقت لاحق في مرحلة الإصلاح ، يتم فقدان تلطيخ K14 حيث يميز البشرة عن الداخل الخارجي.
يمكن أيضا استخدام تلطيخ التركيب الكامل لدراسة التعبير عن علامات الجرح الأخرى ذات الصلة في الجلد وتوطينها ، بالإضافة إلى وجود خلايا مناعية ذات أهمية في موقع الجرح في مراحل مختلفة من الشفاء. توليد جروح ختانية قابلة للاستنساخ يمكن أن يكون تحديا في البداية. ننصح بممارسة إجراء الجرح باستخدام فائض الجلد.
