وصفت هذه الورقة طريقة بسيطة لجرد الجرح في نظام نموذج ثقافة الجهاز متعدد الأبعاد والخلوية ثلاثي الأبعاد. نحن نفعل ذلك باستخدام عيون الخنزير، ولكن حتى لو كنت غير مألوفة مع العينين، يمكنك القيام بذلك الفحص. كنظرة عامة، تلقينا عيون porcine، وقطع الكرة الأرضية، وجعل الجرح الدائري في القرنية التي تمر عبر ظهارة وحوالي ثلث ستروما.
نقطع القرنية، ونثبتها على قاعدة أجار، ونضع هذا البناء في الحاضنة. الأنسجة سوف تملأ في خلق ندبة في القرنية. لا تحتاج إلى إضافة أي عوامل النمو، أو حتى المصل.
ويتم ذلك في وسائل الإعلام خالية من المصل. على الرغم من أن يتم تنفيذ هذا في القرنية، ويمكن استخدامه كنظام نموذجي للشفاء الليفي بشكل عام. كما العديد من المسارات الخلوية التي يتم تنشيطها أثناء تندب متشابهة بين النظم.
في غطاء غطاء محرك السيارة للسلامة البيولوجية، استخدم شفرة جراحية على حافة مستقيمة لإزالة الكرة الأرضية من الغطاء على لوحة تقطيع تنظيف الإيثانول، وإزالة الأنسجة الدهنية الزائدة من كل عين. عقد العالم تنظيفها في وقت ما بعد مع ملقط تراجع على الفور العين في برنامج تلفزيوني تليها ثلاثة انخفاضات سريعة في 10٪ اليود، واثنين من الانخفاضات السريعة في برنامج تلفزيوني. ثم لف العين محيطاً مع أنسجة مختبر نظيفة لتلتف مع ما يكفي من الضغط لتحقيق سطح القرنية مشدود دون الاتصال القرنية.
باستخدام التربهينات الستة ملليمترات، تخترق الظهارة في الستروما الأمامية في وسط القرنية دون إجراء جرح كامل السمك من خلال القرنية بأكملها، وتدوير الترفين 180 درجة في اتجاه عقارب الساعة ومضادة عقارب الساعة خمس مرات مع تطبيق ضغط الضوء لتعميق الجرح. عندما يكون الجرح عميقًا بما يكفي للسماح برفع رفرف الأنسجة بالملقط ، استخدم شفرة جراحية لقطع رفرف موازٍ للعالم مع الاستمرار في رفع القرنية الأمامية ضمن هامش الجرح. عندما تتم إزالة رفرف كامل، يجب أن يكون موجودا الجرح الدائري في وسط القرنية.
لحصاد القرنية فهم العين مع أنسجة المختبر، واستخدام شفرة الجراحية لجعل شق صغير ملليمتر واحد بعيدا عن حافة القرنية لتشمل جمع limbus والأنسجة. باستخدام مقص صغير، حاد مواصلة شق في جميع أنحاء العالم حفظ هامش ملليمتر عبر القرنية للحفاظ على limbus في لباقة. ثم ضع القرنية، جانب الجرح إلى أسفل، في طبق 60 ملليمتر، أو 100 ملليمتر يحتوي على ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني.
لتركيب القرنية، استخدم زوجين من ملقط لعقد القرنية الظهارية الجانب حتى لخلق كوب، واستخدام ماصة نقل العقيمة لإضافة محلول أجار دافئ في القرنية حتى الكأس الكامل. بعد تصلب أجار، ضع القرنية بعناية في لوحة جديدة من 60 ملليمترًا على الجانب الأسفل وقم بتغطية الطبق بغطاء. ثم تضاف أربعة ملليلترات من المتوسط الخالي من المصل التكميلي إلى كل صفيحة من القرنيات التي تحافظ على القرنيات عند واجهة هوائية سائلة على الحدود الطرفية في حاضنة لثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ من ثاني أكسيد الكربون، وتبلل الأسطح القرنية مرة واحدة يومياً مع قطرة واحدة من المتوسطة الخالية من المصل التكميلية من المتوسط المكيف في الطبق للحفاظ على رطوبة الأنسجة.
بالنسبة للجينات النازلة ، اخلط خمسة ميكرولترات من التداخل الصغير أو siRNa مع 50 ميكرولترات من الحد الأدنى من المتوسط الأساسي في المصل واثنين من microliters من كاشف transfection. مع 50 ميكرولترات من متوسطة المصل المخفضة لكل قرنية. بعد خمس دقائق، اخلطي خليطين معًا، وأضيفي 200 ميكرولترات من الحد الأدنى لمصل المصل المتوسط لكل خليط من الـ سيرنا.
ثم الماصات حلول سيرنا إسقاط الحكمة على كل جرح. ثم ضع القرنيات في الحاضنة. بعد ثلاث ساعات، استخدم المتوسط في كل طبق لغسل الـ سيرنا من أسطح القرنية، واستبدل الوسط المكيف في كل طبق بمصل جديد مجاني بالإضافة إلى المضادات الحيوية.
ثم إعادة الثقافات القرنية إلى حاضنة ثقافة الخلية، واحتضان لمدة أسبوعين. بعد ست ساعات من الإصابة ، ظهارة القرنية غائبة. بعد ستة أيام من الإصابة، ظهارة تنمو.
الفلوريسنس الأمينية تلطيخ مع ألفا العضلات الملساء actin يكشف عن تدرج من myofibrobroblasts النشطة على طول هامش الجرح من الأمامي إلى ستروما الخلفي. مناعية هيستوكيميائية تلطيخ ألفا العضلات الملساء actin يكشف عن زيادة كبيرة في ألفا العضلات الملساء actin بروتين التعبير في الجرحى بالإضافة إلى التحكم القرنيات سيرنا. بالمقارنة مع البروتين غير المُجَوَّل والهادف الذي عالجته الـ(سيرنا) القرنية المجروحة.
وبالمثل، يتم رفع النطاق الإضافي في الليفية A في القرنيات المعالجة في سيرنا مقارنة بالبروتين غير المُجَوَّل والهادف الذي عالجته سيرنا القرنيات المجروحة. إظهار نجاح هدم البروتين المستهدف. وعلاوة على ذلك، علاج القرنيات الجرحى مع السم الذي يستهدف بشكل غير محدد البروتين الهدف يمنع إعادة الظهارة ويؤدي إلى موت الخلايا النوعية، ومصفوفة غير منظمة، وvacuoles stromal مما يشير إلى أن السم لا يشجع الشفاء في تركيز مقايسة.
في الختام، في حين تحاول هذا الإجراء من المهم أن نتذكر أن تبقي شفرة موازية للأنسجة في حين قطع، بحيث لا تخترق الكرة الأرضية. ويمكن استخدام تقنيات مختلفة جرح مع هذا الفحص، بما في ذلك حرق الكيميائية أو كشط الظهارية. ويمكن أيضا أن تستخدم لمقايس سمية المخدرات لتحديد ما إذا كان ظهارة يشفي وعلى أي معدل.
هذا هو التوفير في التكاليف السابقين vivo، الجهاز نظام نموذج ثقافة التي يمكن أن تسبق الخاص بك في دراسات الشفاء الجروح الجسم الحي.
