لويحات الأميلويد مطلوبة لتشخيص مرض الزهايمر. ومع ذلك ، فهي ليست كافية. وعلى الرغم من هذه الحقيقة، فإنها لا تزال غامضة ويرجع ذلك جزئيا إلى التحديات في توصيف محتوياتها.
بروتوكولنا فعال للغاية في عزل ألياف الأميلويد بدرجة عالية من النقاء وهو مناسب تماما لفهم التفاصيل الدقيقة للهيكل والتكوين. قد تساعد معرفة محتوى البروتين في لويحات الأميلويد في تحديد أهداف التدخل العلاجي التي قد تؤخر أو تتداخل أو تمنع تراكمها. لذلك ، تأخير بداية المرض.
هذه الطريقة مناسبة تماما لاستخراج رواسب البروتين من أنسجة المخ المتدهورة ومجاميع البروتين في مسارات البروتين الأخرى المختلفة. ابدأ بوضع منطقة أنسجة المخ المجمدة الطازجة أو المجمدة في أنبوب من ملليلتر يحتوي على ستة إلى ثمانية حبات من السيراميك في مخزن مؤقت للتجانس البارد المعد حديثا. ثم قم بطحن الأنسجة باستخدام مجانس مطحنة الخرز عند 4000 دورة في الدقيقة مع دورتين من 30 ثانية على وخارج النبض.
الآن أضف تسعة ملليلترات من المخزن المؤقت للتجانس البارد على الجليد إلى ملليلتر واحد من تجانس أنسجة المخ وأنبوب 15 ملليلتر وختمه بشرائط فيلم الشمع المختبري. لضمان قابلية ذوبان قوية، حافظ على دوران الأنبوب طوال الليل عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، أضف السكروز الصلب إلى تعليق مستخلص الأنسجة إلى تركيز نهائي من 1.2 مول.
خلط جيدا وأجهزة الطرد المركزي كان 250،000 × غرام لمدة 45 دقيقة عند أربع درجات مئوية. بعد التخلص من السوبرناتانت ، أعد تعليق الكريات في ملليلتر من المخزن المؤقت للتجانس الذي يحتوي على 1.9 سكروز مولي عن طريق التثليث وأجهزة الطرد المركزي عند 125،000 × g لمدة 45 دقيقة عند أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، قم بنقل الطبقة الصلبة البيضاء العلوية إلى أنبوب جديد وقم بإذابة ملليلتر واحد من المخزن المؤقت للغسيل البارد بالثلج عن طريق الملاعبة لأعلى ولأسفل عدة مرات.
نظرا لأن الكريات غنية أيضا بألياف الأميلويد ، تخلص من الطبقة الوسطى المائية وادمج الكريات مع الطبقة العليا للحصول على عائد أعلى. الطرد المركزي للكسور مجتمعة عند 8،000 × غرام لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. بعد التخلص من السوبرناتانت ، أعد تعليق الكريات في ملليلتر واحد من عازل الهضم البارد للثلج واحتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث ساعات على دوامة.
قم بالطرد المركزي للعينة مرة أخرى ، ثم اغسل الكريات مرتين في ملليلتر واحد من المخزن المؤقت Tris البارد بالجليد وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى. بعد الغسيل الثاني ، أعد تعليق الكريات في ملليلتر واحد من المخزن المؤقت للذوبان عن طريق السحب لأعلى ولأسفل وبسرعة الطرد المركزي للأنبوب عند 200،000 × g لمدة 60 دقيقة عند أربع درجات مئوية. احفظ الكريات ، ثم قلل تركيز السكروز من 1.3 إلى مول واحد عن طريق إضافة 50 ملليمولار تريس المخزن المؤقت إلى السوبرناتانت.
قم بطرد مركزي للجهاز الخارق مرة أخرى ، ثم قم بإذابة كل من الكريات و 100 ميكرولتر من مخزن Tris العازل الذي يحتوي على 0.5٪ SDS. لتنقية الأميلويد ، قم بإذابة الكريات الغنية بالأميلويد باستخدام الموجات فوق الصوتية في جهاز صوتنة الحمام لمدة 20 دورة ، ثم قم على الفور بالطرد المركزي للمادة عند 20،000 × g لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. أعد تعليق الكريات في 500 ميكرولتر من 0.5٪ SDS Tris العازلة وكرر الغسيل أربع مرات أخرى ، بعد خطوة الطرد المركزي النهائية ، اغسل الكريات في 200 ميكرولتر من الماء فائق النقاء وأجهزة الطرد المركزي 20،000 × جم لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية لإزالة أي منظف متبقي.
قم بإذابة الكريات النهائية التي تحتوي على ألياف أميلويد نقية في 100 ميكرولتر من الماء فائق النقاء. قم بإذابة 100 ميكرولتر من ألياف الأميلويد النقية في 400 ميكرولتر من الميثانول والدوامة جيدا. ثم امزج 100 ميكرولتر من الكلوروفورم والدوامة مرة أخرى.
بعد ذلك ، أضف 300 ميكرولتر من الماء فائق النقاء والدوامة جيدا. بعد الطرد المركزي عند 12،000 × g لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة ، قم بإزالة الطبقة المائية العليا بعناية دون إزعاج طبقة الواجهة التي تحتوي على رقائق البروتين وإضافة نفس الحجم من الميثانول مرة أخرى. كرر الطرد المركزي ، وتخلص من supernatant وتجفيف الكريات في الهواء.
للهضم ، قم بإذابة الكريات في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت لهيدروكلوريد جوانيدين وسونيكات في حمام ماء بارد مثلج. ثم دوامة تماما لمدة 45 دقيقة إلى ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، إضافة 50 ميكرولتر من محلول الفاعل بالسطح 0.2 ٪ والدوامة مرة أخرى لمدة 60 دقيقة أخرى. بعد ذلك ، أضف ميكرولتر واحد من 500 ملليمولار TCEP واحتضنه لمدة 60 دقيقة.
ثم أضف ميكرولترين من يودواسيتاميد 500 ملليمول واحتضنه في الظلام لمدة 20 دقيقة. بعد الحضانة ، قم بإخماد يودواسيتاميد بخمسة ميكرولترات من محلول TCEP لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، أضف الحجم المطلوب من محلول بيكربونات الأمونيوم 50 ملليمولار إلى الأنبوب لتقليل تركيز الجوانيدين إلى 1.5 مول.
أيضا ، إضافة محلول 1 ٪ السطحي إلى الأنبوب. ثم أضف التربسين واترك الأنبوب يختلط عند 37 درجة مئوية طوال الليل. في اليوم التالي ، أضف حمض الفورميك إلى محلول الببتيد المهضوم لخفض الرقم الهيدروجيني إلى 2.0 ، ثم قم بتنشيط عمود الدوران C18 بإضافة 200 ميكرولتر من محلول الميثانول بنسبة 50٪ والدوران عند 1500 × g لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.
بعد ذلك ، قم بموازنة أسرة راتنج عمود C18 عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتوازن والدوران مرة أخرى لمدة دقيقتين. بعد التوازن ، قم بتحميل محلول الببتيد المحمض على عمود C18 وأجهزة الطرد المركزي عند 1500 × g لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. أعد تحميل التدفق من خلاله، وقم بتدوير العمود، وتخلص من التدفق الثاني من خلاله.
ثم اغسل الببتيدات المرتبطة براتنج C18 مرتين باستخدام المخزن المؤقت للغسيل. قم بالتخلص من الببتيد ثلاث مرات عن طريق إضافة 40 ميكرولتر من المخزن المؤقت للإزالة والطرد المركزي للعمود. جفف الببتيدات في مكثف فراغ السرعة عن طريق تبخير المحلول المائي.
يمكن حفظ الكريات الجافة عند 20 درجة مئوية لبضعة أسابيع قبل تحليل مرض التصلب العصبي المتعدد. يوثق تلطيخ الكونغو الأحمر للأميلويد النقي إثراء ألياف الأميلويد مقارنة بالكسر القابل للذوبان في SDS. لم يظهر الجزء القابل للذوبان SDS وجود الأميلويدات.
أكد هيكل الألياف النقية وجود ألياف أميلويد نقية تقريبا. أيضا ، أكدت العلامات المناعية وجود ببتيدات أميلويد بيتا 42. أظهر التلطيخ باستخدام الأجسام المضادة المضادة للأميلويد بيتا 42 والأجسام المضادة للألياف وفرة نسبية من ببتيدات بيتا 42 أميلويد في الألياف.
أظهرت كسور الأميلويد النقية وجود ما يقرب من 250 بروتينا ، في حين أن الجزء الذي تم جمعه قبل غسل الموجات فوق الصوتية و SDS يحتوي على أكثر من 2،500 بروتين. أظهرت النوى الليفية إثراء البروتينات المرتبطة بالعضيات غير المرتبطة بالغشاء والمجمعات فوق الجزيئية. الأميلويد هي أنواع منخفضة الوفرة ، ربما بضعة بيكوغرام إلى بضعة ميكروغرام لكل ملليغرام من أنسجة المخ.
لذلك عليك أن تكون حذرا للغاية أثناء التقاط الطبقات أو المنصات أو التخلص من السوبرناتانت. مع تطوير هذه التقنية ، يمكنك الآن تحديد البروتينات المرتبطة ببذور الأميلويد الأولية بثقة أكبر ، وتوصيف هيكلها واستهدافها للتدخل العلاجي. لذلك ، منع ظهور هذا المرض القاتل.
