في هذا الفيديو، نحن وصف دراسة نموذجية لآلية سمية اميلويد على مستوى الغشاء باستخدام الميتوكوندريا الدماغ الفئران كنموذج بيولوجي في المختبر. على الرغم من تراكم التقرير وصف آلية الأغشية الانزعاجات بواسطة الأميلويد تجميع في نظم نموذج فوسفوليبيد درس مباشرة استهداف الأحداث التي تبدأ في تطوير الغشاء البيولوجي. في هذا الفيديو، ونحن وصف fibrils اميلويد من ألفا سينوكلين تحليل غشاء الميتوكوندريا الدماغ الفئران كنموذج بيولوجي في المختبر.
ونحن نعتقد أن الميتوكوندريا باعتبارها organelle مع أغشية جيدة اميز قد توفر مفيدة للغاية البيولوجية نموذج نظام للدراسات الجزيئية المتعلقة آلية السمية الخلوية اميلويد على مستوى الغشاء المتعلقة بأمراض الأعصاب. قطع رأس الجرذ مع مقصلة صغيرة وإزالة الدماغ من الجدول في غضون دقيقة واحدة من قطع رأس الفئران للحد من التدهور المحتمل لخصائص الميتوكوندريا. من المهم العمل بسرعة والحفاظ على كل شيء على الجليد طوال العملية.
غسل الأنسجة مرتين مع 30 ملليلتر من العازلة العزل. نقل إلى منقار يحتوي على عازلة العزل الباردة و mince ناعما الدماغ مع مقص. نقل تعليق الأنسجة إلى 20 ملليلتر التجانس الباردة dounce.
التجانس قطع الأنسجة باستخدام تسعة السكتات الدماغية صعودا وهبوطا مع آفة آلية. اترك الخليط على الجليد لمدة 30 ثانية تقريبًا بعد كل مجموعة من ثلاث ضربات تجانس لضمان بقاء التجانس باردًا. نقل المتجانس إلى أنبوب أجهزة طرد مركزي مُبردة مسبقاً وطاردة مركزية على 1,300 غ في أربع درجات لمدة ثلاث دقائق.
بعناية طارد المابير ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي المبردة مسبقا. جهاز طرد مركزي في 21،000 G في أربعة درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. تجاهل السوبر و resuspend بيليه في متوسطة التدرج الكثافة عن طريق تحريك بلطف الخليط مع ماصة.
جهاز طرد مركزي في زاوية ثابتة الدوار في 30، 700 G في أربعة درجة مئوية لمدة خمس دقائق. باستخدام ماصة باستور، وإزالة نهاية حادة من المواد المتراكمة في الجزء العلوي، والتي تحتوي في الغالب على الميلين. إضافة ثمانية ملليلتر العازلة العزل إلى كسر الميتوكوندريا في حين التحريك بلطف الخليط مع ماصة.
جهاز طرد مركزي في 16،700 G في أربعة درجة مئوية لمدة 10 دقائق. إزالة بعناية supernatant، وترك بيليه فضفاضة أسفل دون عائق. إضافة ملليلتر واحد 10 ملليغرام لكل ملليلتر الدهنية خالية من الأحماض BSA إلى أنبوب الطرد المركزي في حين اثارة بلطف الخليط مع غيض من ماصة.
قم بتكفير وحدة التخزين إلى خمسة ملليلتر عن طريق إضافة مخزن العزل المؤقت. جهاز طرد مركزي في 6,900 G في أربعة درجة مئوية لمدة 10 دقائق. هذا ينبغي أن تنتج بيليه شركة.
Decant الماسخ وssuspend بلطف بيليه الميتوكوندريا في عازلة العزلة. تمييع المتجانسة الميتوكوندريا إلى مليغرام واحد لكل ملليلتر مع عازلة العزل الباردة ومكان في اثنين من أنابيب 1.5 ملليلتر, عادة 195 ميكرولتر من الميتوكوندريا لكل أنبوب. إضافة خمسة ميكروليتر 20٪ حجم لكل حجم تريتون X-100 إلى أنبوب واحد كتحكم إيجابي للحد الأقصى من نشاط الانزيم وخمسة ميكرولتر ديونسيد المياه إلى أنبوب آخر للسيطرة، تليها خلط مع مُحرك.
احتضان الأنابيب لمدة 10 دقائق في حمام الماء الدافئ تعيين إلى 30 Centigrade. بيليه الميتوكوندريا بواسطة الطرد المركزي من الأنابيب في دوار زاوية ثابتة في 16، 000 G أربعة سنتيغراد لمدة 15 دقيقة. جمع بعناية عظمى الناتجة لتقييم نشاط الميتوكوندريا مالات dehydrogenase باستخدام المعايرة الطيفية القياسية المذكورة في الجزء التالي.
حساب سلامة الغشاء الميتوكوندريا على النحو التالي. لتحديد نشاط malate dehydrogenase, ماص 890 و 880 ميكرولتر 50 ملليمولار تريس-HCL العازلة إلى فارغة وعينة اختبار cuvettes على التوالي تليها 100 ميكرولتر 50 ملليمولار oxaloacetate و 10 ميكرولتر من 10 ملليمولر بيتا-NADH. وضع cuvettes في مقياس الطيفية والمرجع ضد فارغة.
إضافة 10 ميكرولتر الميتوكوندر المتجانسة التجانس واحد ملليغرام لكل ملليلتر لعينة من cuvette. على الفور مزيج من قبل عكس. انخفاض قياسي في الامتصاص بسبب أكسدة NADH عند 340 نانومتر لمدة دقيقة واحدة.
لالفا-سينوكلين الرجفان اميلويد، إضافة 294 ميكرولتر من محلول البروتين، 200 ميكرومولار إلى كل 1.5 ملليلتر أنبوب. ثم إضافة ستة ميكروليتر ThT الحل واحد ملليمتر. اخلط الحلول وحضن الأنابيب في ثيرمميكسير في 37 درجة مئوية تحت التحريك المستمر عند 800 دورة في الدقيقة.
بالنسبة للرجفان الـفيني للأنسولين، أضف 637 ميكرولتر من محلول البروتين، و250 ميكرومولار إلى 1.5 ملليلتر. ثم إضافة 13 ميكروليتر ThT الحل واحد ملليمولار تليها التحريك. إضافة aliquots 200 ميكرولتر من حلول البروتين إلى كل بئر من لوحة 96-well السفلي واضحة.
ختم لوحة مع شريط ختم واضحة وضوح الشمس. تحميل لوحة في Cytation 5 قارئ لوحة الفلوريس. قياس الفلورس ThT على فترات 30 دقيقة لمدة 12 ساعة.
استخدام الإثارة في 440 نانومتر والانبعاثات في 485 نانومتر. حدد الآبار. هز اللوحة لمدة خمس ثوان قبل كل قياس.
تعيين درجة الحرارة في 57 درجة مئوية دون التحريض. إعداد اثنين من سلسلة من 1.5 ملليلتر أنابيب تحتوي على تجانس الميتوكوندريا, سلسلة واحدة لمقايسة الافراج عن MDH وغيرها لقياس الميتوكوندريا روس. إضافة aliquots من fibrils الطازجة أو اميلويد من ألفا-synuclein, الأنسولين البقري أو البيض البيض الدهاني lysozyme إلى المتوفيات المتينزية تليها الأنابيب بلطف.
ينبيّن أنابيب تحتوي على تعليق الميتوكوندريا لمدة 30 دقيقة في حمام الماء الدافئ الذي تم تعيينه إلى 30 درجة مئوية. بالنسبة لمقايسة إطلاق الانبعاثات من malate dehydrogenase، فإن أجهزة الطرد المركزي المحتضنة تتجانس الميتوكوندريا عند 16000 G لمدة 15 دقيقة. جمع بعناية عظمى الناتجة عن فحص نشاط MH الميتوكوندريا كما هو موضح في قسم البروتوكول الجزء الرابع.
حساب إصدار MDH كما يلي. لقياس الميتوكوندريا ROS، ماص 191 ميكرولتر من المتجانسة الميتوكوندريا المحتضنة إلى كل بئر من لوحة 96 جيدا. إضافة أربعة ميكرولتر من 50 micromolar DCFDA.
ثم إضافة خمسة ميكرولتر من 200 ميليمولار كسيناث. احتضان لوحة لمدة 30 دقيقة في حمام الماء الدافئ تعيين إلى 30 درجة مئوية في حين اثارة بلطف. تحميل لوحة في Cytation 5 قارئ لوحة الفلورانس وقياس كثافة الفلورانس وفقا لقسم البروتوكول.
تم تقييم سلامة غشاء الميتوكوندريا من خلال قياس نشاط MDH في الميتوكوندريا المعزولة قبل وبعد اضطراب الغشاء وإطلاق الإنزيم بواسطة Triton X-100. كما ترون، وجدنا عادة أن الاستعدادات الميتوكوندريا حوالي 93٪ سليمة. تم إجراء مقايسة ThT fluorescence لمراقبة نمو الفيبريات الأميلويد.
أظهر منحنى الرجفان الأميلويد من ثلاثة بروتينات نمطًا سيغريمي نموذجيًا ، ليصل إلى هضبة في حوالي 96 و 12 و 96 ساعة لـ ألفا سينوكلين ، وأنسولين الأبقار ، وبيضة البيض lysozyme على التوالي ، مما يشير إلى تشكيل fibrils الأميلويد الذي تم تأكيده أكثر من خلال قياس AFM. تم التحقيق في إمكانية تحقيض الغشاء الميتوكوندريا وتلفه بواسطة الفيبرلس الأميلويد من خلال إطلاق MH الميتوكوندريا وقياس الميتوكوندريا ROS. كما ترون في الرسم البياني الأيسر، لوحظ إصدار كبير من MDH عند إضافة ألفا سينوكلين فيبريه إلى الميتوكوندريا.
في حين تم الكشف عن إطلاق سراح طفيف من قبل فيبريلس الأنسولين، تم العثور على البيض البيض lysozyme fibrils غير فعالة. الرسم البياني الأيمن يظهر تأثير fibrils اميلويد على محتوى ROS الميتوكوندريا. في حين لم يلاحظ أي تحسن كبير في الميتوكوندريا ROS عند إضافة البيض البيض lysozyme أو الانسولين اميلويد فيبريلس, العلاج مع ألفا-سينوكلين فيبريلس أدى إلى زيادة كبيرة في محتوى روس من الميتوكوندريا الدماغ.
يصف هذا الفيديو دراسة نموذجية لآلية السمية الخلوية الكلية للظيّل على مستوى الغشاء، مما يوضح كيف أن الـ fibrils الأميلويد الناشئة عن البروتينات المختلفة قد تسبب درجات مختلفة من تلف الغشاء و permeabilization. في حين أن بعض المواضيع من fibrils اميلويد والغشاء المحدد ملزمة يبدو أن توفر القدرة على التفاعل مع وتسبب زعزعة الاستقرار والتمزقات اللاحقة من الأغشية. بعد هذا الفيديو، سوف تكون قادرة على التحقيق في التفاعل من شكل الأصلي، قبل الفيبريلار، و fibrils الأميلويد ناضجة من الببتيدات المختلفة ومع الميتوكوندريا معزولة عن الأنسجة المختلفة أو مناطق مختلفة من الدماغ.
