يعد التصوير الطيفي Maldi MS أداة راسخة ومفيدة لتحديد وتصور وفرة الدهون وتوزيعها ، دون تعديل مفرط في العينة. الميزة الرئيسية لتصوير Maldi هي قدرته على اكتشاف الدهون في الموقع دون وضع العلامات ، وتحليل عدد كبير من العينات في وقت واحد. التكرار يعلم الشطار.
تأكد من أنك تتدرب جيدا قبل معالجة العينات التجريبية الحقيقية. قلل من وقت إعداد العينة وتجنب التلوث طوال الإجراء. للبدء ، أضف درجة حرارة القطع المثلى ، أو OCT إلى مبرد بلاستيكي إلى نصف عمق قالب التبريد مع تجنب تكوين الفقاعة.
اترك القالب على سطح مستو لعدة دقائق ثم انقله إلى الثلج الجاف. حافظ على الثلج المبرد مسطحا على الثلج الجاف واسمح ل OCT بتكوين سطح مستو ومتساو. انتظر حتى يتم تصلب OCT بالكامل في القالب.
استخدم مراحل OCT المجمدة على الفور ، أو قم بتخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. بعد تخدير الذباب البالغ باستخدام ثاني أكسيد الكربون ، قم بإعداد طبق بتري يحتوي على قطعة من المسح المختبري. استخدم الماء لترطيب جزء من المسح لتقليل الكهرباء الساكنة.
حافظ على المسح نصف مبلل ونصف جاف. بعد قطع رأس الذبابة تحت نطاق تشريح واحد ، اجمع أربعة إلى خمسة رؤوس وضعها على المنطقة الجافة من مسح المختبر. خذ مرحلة OCT من الثلج الجاف إلى المجهر الثاني.
انقل الرؤوس على الفور إلى مرحلة OCT ورتبها بسرعة ، والتي تستغرق حوالي 30 إلى 60 ثانية لتجنب ذوبان OCT. اترك حوالي ملليمتر واحد من المساحة الفارغة حول كل دماغ ذبابة لضمان الدعم الكافي من OCT وأربعة إلى خمسة ملليمترات من المساحة الفارغة من حافة الكتلة لتوفير مساحة كافية للتعامل مع القسم. ضع مرحلة OCT مرة أخرى على الثلج الجاف واتركها تبقى لمدة ثلاث دقائق تقريبا للتأكد من أن مرحلة OCT تظل مجمدة وصلبة.
بعد محاذاة جميع رؤوس الذباب ، دع مرحلة OCT تجلس على الثلج الجاف لمدة خمس إلى 10 دقائق أخرى. انقل مرحلة OCT من الثلج الجاف إلى سطح مستو ثم أضف بسرعة كمية كبيرة من مركب OCT لتغطية جميع العينات وملء القالب المبرد بالكامل ، والذي يستغرق حوالي ثلاث ثوان. انقل المبرد على الفور إلى الثلج الجاف وقم بتجميد كتلة OCT بأكملها التي تحتوي على الأنسجة المدمجة.
دع مرحلة OCT تجلس على الثلج الجاف لمدة خمس إلى 10 دقائق أخرى. ضع علامة على العينات على هامش cryomold وخزن العينات المجمدة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى تصبح جاهزة للتقسيم. قم بتأكيد الجانب المشفر من ITO عن طريق اختبار الموصلية لشرائح ITO باستخدام مقياس فولت مضبوط على المقاومة.
ضع علامة على الجانب بقياس المقاومة كجانب للالتصاق بالأنسجة. قم بتسميته واضبط دائما مسحا مختبريا على الجزء السفلي من الشريحة لتجنب تلوث الشريحة. ثم ، اسمح للأنسجة بالتوازن في غرفة cryostat لمدة 30 إلى 45 دقيقة.
نظف الكريوستات ، ويفضل أن يكون ذلك باستخدام 70٪ من الإيثانول. امسح لوحة اللفة في المرحلة وقم بإزالة الشفرات المستخدمة. استخدم مناديل نظيفة إضافية للتأكد من تبخر الإيثانول وأن جميع الأسطح جافة قبل بدء التقسيم.
بعد ذلك ، اضبط درجة حرارة رأس عينة رمل غرفة cryostat وفقا لنوع الأنسجة. قم بتركيب الأنسجة على حامل العينة باستخدام OCT. احرص على استخدام ما يكفي من OCT لتغطية قاعدة كتلة OCT وتركيب الكتلة بشكل مسطح قدر الإمكان.
ضع شفرة نظيفة على المسرح وقم بقفلها. ضع رأس العينة نحو المرحلة حسب الحاجة لتحقيق زاوية القطع المطلوبة. ثم ابدأ القطع في أقسام سميكة حتى يتم العثور على المنطقة ذات الاهتمام.
قم بتنظيف القطع الإضافية باستمرار باستخدام فرشاة فنية مبردة مسبقا للحفاظ على نظافة المسرح. اضبط درجة حرارة الغرفة قليلا حسب الضرورة وقم بتغيير سمك الأقسام إلى 10 إلى 12 ميكرومتر بمجرد الوصول إلى المنطقة المطلوبة. جمع بعناية القسم المطلوب.
خذ شريحة ITO بدرجة حرارة الغرفة وضعها فوق القسم. اقترب من القسم بلطف وألصقه بالشريحة دون ترك آثار على مرحلة cryostat. ضع الشريحة جانبا في رف ، أو امسح المختبر خارج cryostat بين مجموعات من أقسام متعددة.
إذا كانت المقارنة بين عينات مختلفة من نفس المجموعة مطلوبة، ضع الأقسام من عينات متعددة على شريحة واحدة بحيث يمكن تحليلها في وقت واحد لتقليل التباين. إذا لزم الأمر ، افصل إلى شريحتين ، حيث يمكن لحامل هدف Maldi استيعاب شريحتين في تشغيل واحد. انقل الشرائح في صندوق فراغ إلى مجفف مع تجفيف كطبقة سفلية.
قم بقيادة الشرائح تحت فراغ لمدة 30 إلى 60 دقيقة ، ثم انتقل إلى ترسب المصفوفة. استخدم اثنين من حمض البنزويك ثنائي هيدروكسي خمسة ، أو DHB ، في ماء الميثانول كمصفوفة. ضع الشرائح في ناقل الشرائح وأغلق الفتحة بإحكام باستخدام فيلم الشمع.
ختم مع حقيبة سحاب. ضعه في كيس سحاب آخر يحتوي على مجفف. قم بتسمية الخارج وشحن العينة إلى مرافق مالدي الأساسية ذات العيون الجافة الكافية.
لترسيب المصفوفة ، استخدم 40 ملليغرام لكل ملليلتر من DHB وماء الميثانول كمصفوفة ورشها باستخدام بخاخ مصفوفة HTX M5 التلقائي. استخدم ضغط غاز النيتروجين البالغ 10 رطل لكل بوصة مربعة. استخدم وقت طيران مالدي وأداة MS ووضع الأيونات الموجبة للحصول على طيف كتلي.
معايرة الأداة عن طريق اكتشاف 0.5 ميكرولتر من مستحلب الفوسفور الأحمر في أسيتو نيترو على شرائح ITO. استخدمه أطياف لمعايرة الأداة في نطاق كتلة 100 إلى 1000 ميجا هرتز عن طريق تطبيق منحنى معايرة تربيعي. اضبط أقطار بقعة الليزر على الوسط لأنها ملف تعريف الشعاع المعدل لعرض البيانات النقطية 40 ميكرومتر ، وجمع بيانات التصوير عن طريق جمع 500 لقطة بمعدل تكرار ليزر يبلغ 1000 هرتز لكل موضع صفيف.
ثم سجل البيانات الطيفية. قم بإجراء تحليل بيانات التصوير باستخدام تطبيع مربع متوسط الجذر لإنشاء صور أيون عند عرض نطاق ترددي زائد ناقص 0.10 دالتون. قم بمحاذاة أطياف كل من OCT وأنسجة المخ من نفس التجربة باستخدام البرنامج لتقييم القمم المتداخلة في تداخل قمع الأيونات في OCT.
أخيرا ، قم بمعالجة شرائح MALDI التي تحتوي على عينات الأنسجة بواسطة الهيماتوكسيلين والإيوسين ، أو تلطيخ H و E. كشفت صور من تحليل Maldi MS عن انخفاض عام في محتويات الدهون في الدماغ المتحور LPR1 بالضربة القاضية. يتم عرض أقسام دماغ الذبابة البالغة الملطخة H و E التمثيلية هنا.
يشار أيضا إلى أنواع الدهون وقيم MZ الخاصة بها ومقاييس الخريطة الحرارية في هذه الصورة. يتم عرض متوسط أضعاف الانخفاض في متحور LPR1 بالضربة القاضية مقارنة بالضوابط من أربعة نسخ بيولوجية على الأقل ، كأرقام بجوار الأسهم. يظهر الطيف الكتلي لمنطقة OCT الفارغة المختارة في منطقة أنسجة المخ من كل من الذباب الضابطة والمتحورة في نطاق MZ1 إلى 1000 و MZ520 إلى 900.
يرتبط تداخل OCT بكل من ظواهر قمع الأيونات وقضايا الإشارة المتداخلة. للحفاظ على دقة بيانات الدهون ، يعد إعداد العينات المناسبة وتشريحها وتقسيمها بالتبريد أمرا بالغ الأهمية. بعد إجراء تجربة مالدي ، يمكن التحقق من هويات الدهون من خلال LCMS ، المعروف أيضا باسم الكروماتوغرافيا السائلة ، وعلم الدهون القائم على قياس الطيف الكتلي.
تكتسب هذه التقنية رؤى جزيئية حول توازن الدهون في الدماغ باستخدام نظام النموذج القوي إلى الناعم الذي يمهد الطريق لفهم التغيرات الأيضية المرتبطة بالأمراض البشرية في الدماغ.
