يتيح هذا البروتوكول المعياري استكشاف أحداث جزيئية متعددة ناتجة عن الدهون الهيكلية والإشارات و / أو الحمض النووي الريبي ، في مناطق الأنسجة السرية وفي الدم مع تحسين إنتاج البيانات الكمية والنوعية لكل عينة عينة. تنطبق هذه الطريقة على أي نموذج تجريبي ، ويمكن أيضا تطبيقها على عينات الأنسجة البشرية والدم. ستظهر الإجراء كلوديا شويتر ، وهي فنية ، وجوليا بوست ، طالبة دراسات عليا ، وريسا ليرنر ، وهي باحثة ما بعد الدكتوراه في مجموعتي.
للبدء ، خذ أدمغة الفئران المعزولة سابقا والكاملة والمجمدة مع الصرع الحاد والمعالج وقائيا الناجم عن حمض الكاينيك. قم بتركيب الأدمغة على نظام تركيب الكريوستات. اضبط السماكة على 50 ميكرومتر وقم بتقطيع الدماغ في وضع القطع بالقرب من المنطقة محل الاهتمام.
عند الاقتراب من المنطقة ذات الاهتمام ، اضبط السمك على 18 إلى 20 ميكرومتر. لتوطين المنطقة الفرعية ذات الأهمية ، قم بتلطيخ شرائح الدماغ باستخدام التولويدين الأزرق. استخدم المجهر لفحص الشرائح الملطخة لتحديد المناطق ذات الأهمية المراد لكمها ، واستخدم أطلس الماوس كمرجع للعثور على المناطق التشريحية المناسبة للدماغ.
استخدم نماذج من اللكمات لأخذ لكمات قطرها 0.8 إلى 1.0 ملم. انقل اللكمات الخاصة ب endocannabinoids و eicosanoids coextractions إلى أنابيب كهرمان 2 ملليلتر مبردة مسبقا مع سبع كرات فولاذية مبردة مسبقا لكل أنبوب. بالنسبة للدهون الفوسفاتية و endocannabinoids ، والاستخراج المشترك للدهون المزدوجة والحمض النووي الريبي ، قم بنقل اللكمات إلى أنابيب استخراج خالية من RNZE 2 ملليلتر مع حبات السيراميك.
وزن اللكمات المجمدة في الغرفة الباردة والمضي قدما على الفور في استخراج أو تجميد عند 80 درجة مئوية. لإجراء استخراج الدهون السائلة السائلة من endocannabinoids و eicosanoids من قطع الدماغ أو اللكمات أو عينات مسحوق الأنسجة ، ضع أنابيب الاستخراج التي تحتوي على عينات الأنسجة وسبع كرات فولاذية على الجليد. أضف 600 ميكرولتر من MTBE المثلج البارد و 50 ميكرولتر من ماء الأسيتونيتريل الذي يحتوي على المعايير الداخلية.
بعد إضافة 400 ميكرولتر من 0.1 حمض الفورميك المولي ، استخدم محلل الأنسجة للتجانس لمدة 30 ثانية إلى دقيقة واحدة. جهاز طرد مركزي هذا التجانس لمدة 15 دقيقة في 5،000 مرات غرام عند 4 درجات مئوية. ضعه في الفريزر لمدة 10 دقائق عند 80 درجة مئوية لتجميد المرحلة السفلية المائية ، مما سيسهل نقل المرحلة العضوية العليا.
انقل المرحلة العضوية العليا إلى أنابيب كهرمان جديدة سعة 1.5 ملليلتر ، وتبخر تحت تيار لطيف من النيتروجين عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، ثم أعد تشكيلها في 50 ميكرولتر من ماء الأسيتونيتريل لمزيد من التحليل. قم بتخزين المرحلة المائية عند 20 أو 80 درجة مئوية لمزيد من تحليل محتوى البروتين. للمشاركة في استخراج endocannabinoids و eicosanoids من عينات البلازما ، ضع عينات البلازما المجمدة على الجليد واتركها تذوب تماما.
أضف 800 ميكرولتر من MTBE و 50 ميكرولتر من ماء الأسيتونيتريل الذي يحتوي على المعايير الداخلية المحسنة للارتفاع باستخدام عينات البلازما المرجعية. أضف 600 ميكرولتر من 0.1 حمض الفورميك المولي والدوامة عند 4 درجات مئوية لمدة دقيقتين. الطرد المركزي للعينات في 4،000 مرات ز لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
نقل المرحلة العضوية إلى أنابيب جديدة. تبخره تحت تيار لطيف من النيتروجين عند 37 درجة مئوية ، ثم أعد تشكيله ب 50 ميكرولتر من ماء الأسيتونيتريل لتحليل مراقبة التفاعلات المتعددة للكروماتوغرافيا السائلة. لإجراء الاستخراج المشترك للفوسفوليبيد و endocannabinoids من مناطق الدماغ ، واللكمات ، أو غيرها من عينات مسحوق الأنسجة ، ضع أنابيب الاستخراج التي تحتوي على عينات الأنسجة والخرز الخزفي على الجليد.
أضف 800 ميكرولتر من ميثيل تيرت بوتيل الأثير وخليط الميثانول و 10 ميكرولترات من الميثانول تحتوي على المعايير الداخلية. ثم ، أضف 200 ميكرولتر من حمض الفورميك بنسبة 0.1٪ يحتوي على 25 ميكرومولار رباعي هيدروليبستاتين / URB597 و 50 ميكروغرام لكل ملليلتر من BHT. بعد التجانس باستخدام مجانس الأنسجة ، يتم إجراء جهاز طرد مركزي عند 5000 مرة جم و 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.
انقل المرحلة العضوية العليا إلى أنابيب جديدة ، وتبخر تحت تيار لطيف من النيتروجين عند 37 درجة مئوية ، ثم أعد تكوين مستخلص الدهون هذا مع 90 ميكرولتر من الميثانول. إذا استمر على الفور ، أضف 10٪ من الماء إلى أليكوت من مستخلص الدهون وحقن 10 ميكرولترات في LC / MS لتحليل الدهون الفوسفاتية. لمزيد من تحليل endocannabinoid ، تابع الخطوة التالية.
خذ أليكوت من مستخلص الدهون ، وتبخر إلى الجفاف ، وأعد تشكيله في ماء الأسيتونيتريل. لإجراء استخراج مزدوج من الحمض النووي الريبي والدهون والاستخراج المشترك للفوسفوليبيد و endocannabinoids من عينات الأنسجة ، قم بإذابة مسحوق الأنسجة aliquots أو عناقيد الدماغ عند 4 درجات مئوية. أضف الأنسجة إلى أنابيب الاستخراج مع حبات السيراميك.
ثم أضف 600 ميكرولتر من المخزن المؤقت RLT مع 200 ميكرولتر من الكلوروفورم. بالنسبة للفوسفوليبيد والاستخراج المشترك لل endocannabinoid ، قم بتعبئة العينات التي تحتوي على 10 ميكرولترات من الخليط القياسي الداخلي وتجانس بسرعة عالية لمدة 20 ثانية. نقل العينات المتجانسة إلى أنابيب جديدة لأجهزة الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي لمدة خمس دقائق بأقصى سرعة و 4 درجات مئوية لتمكين فصل الطور.
انقل المرحلة العليا إلى أنبوب جديد لاستخراج الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة قياسية. استخرج Elute الحمض النووي الريبي في حجم إجمالي قدره 50 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase وخزنه عند 80 درجة مئوية. لاستخراج الدهون ، أضف 800 ميكرولتر من MTBE / الميثانول و 200 ميكرولتر من حمض الفورميك بنسبة 0.1٪ إلى المرحلة الأقل المحتوية على الكلوروفورم.
دوامة لمدة 45 دقيقة عند 4 درجات مئوية. نقل المرحلة العضوية العليا إلى أنبوب جديد. تبخره تحت تيار لطيف من النيتروجين عند 37 درجة مئوية.
لمزيد من تحليل LC / MS ، أعد تكوين العينة في 90 ميكرولتر من الميثانول وتخزينها عند 20 أو 80 درجة مئوية ، أو انتقل على الفور إلى التحليل. لمزيد من تحليل endocannabinoid ، تابع الخطوة التالية. خذ أليكوت من مستخلص الدهون ، وتبخر إلى الجفاف ، وأعد تشكيله في ماء الأسيتونيتريل.
ثم ، حقن 20 ميكرولتر في LC / MS لتحليل endocannabinoid. أدى تحريض حمض كاينيك لنوبات الصرع الحادة إلى أقصى شدة للنوبة بعد ساعة واحدة من الحقن. يظهر التنميط الشحمي لل endocannabinoids و eicosanoids ، وكذلك الدهون الفوسفاتية و endocannabinoids ، تغيرات في مستوى الدهون عبر القشرة الدماغية ، المخطط ، المنطقة المهادية ، الحصين ، تحت المهاد ، المخيخ وكذلك أنسجة القلب والرئة في الفئران الصرع الناجمة عن حمض كاينيك والضوابط.
بعد الاستخراج المزدوج للفوسفوليبيد و endocannabinoids و RNA للتنميط الكمي لكمات دماغ الفئران ، تم تحليل التوزيع الكمي للدهون في منطقة ما تحت المهاد ، واللوزة القاعدية الجانبية ، والحصين البطني والظهري. مستويات التعبير النسبية للإنزيمات والمستقبلات الداخلية المشاركة في إشارات الدهون ، وكذلك علامات نشاط الدماغ التي تم التحقيق فيها على مستوى الحمض النووي الريبوزي المرسال في مناطق الدماغ المختلفة والمناطق الفرعية من الفئران المعرضة لنوبات الصرع الناجمة عن حمض الكاينيك وضوابطها. تسبب الصرع الناجم عن حمض كاينيك في فقدان هائل لإشارة NeuN ، في الغالب في منطقة CA1 و CA3 و hilus في الحصين ، مصحوبة بأحداث استماتية تشير إليها إشارة caspase-3 مقارنة بالفئران التي يتم حقنها بمحلول ملحي التحكم.
بعد العلاج باستخدام بالميتويل إيثانولاميد شبه المزمن ، تم الحفاظ على إشارة بروتين النوى العصبية بشكل ملحوظ وكانت إشارة CASP3 بالكاد يمكن اكتشافها. يعد لكم الدماغ وتشريح مناطق الدماغ السرية تحديا كبيرا ويتطلب مهارات دقيقة للحصول على عينات متسقة عبر مجموعات متعددة. لذلك ، يوصى بشدة بالممارسة على أجهزة الاختبار والمعرفة الجيدة بمورفولوجيا الدماغ.
