يسمح هذا البروتوكول للباحثين بتحديد الصلات الملزمة للأبتامير ضد الأهداف الحرة في الحل ، مع توفير نظرة ثاقبة لآلية الربط. نظرا لأن مركز التجارة الدولية يقيس التغيرات في الحرارة بسبب الارتباط ، فلا يلزم وضع علامة على الأبتامير أو الرباط أو تشغيلهما ، كما هو الحال بالنسبة لتقنيات مثل SPR. يجب على المستخدمين الجدد إيلاء اهتمام وثيق لمطابقة المخازن المؤقتة عبر جميع مكونات الربط.
بالإضافة إلى ذلك ، كن على دراية بأن هذه التقنية لها متطلبات عينة عالية قد يكون من الصعب تلبيتها للروابط الأكبر مثل البروتينات. للبدء ، قم بتنشيط غشاء عمود غسيل الكلى ، واملأه بمخزن مؤقت PBS ، وازن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وأجهزة الطرد المركزي عند 5،000 مرة G لمدة 15 دقيقة. قم بإزالة المخزن المؤقت وقم بتحميل 500 ميكرولتر من عينات aptamer في العمود.
جهاز طرد مركزي عند 5،000 مرة G وكرره أربع مرات لتبادل المخزن المؤقت الأصلي ل PBS. اجمع أبتامير الحمض النووي المخلل باستخدام ماصة وانقله إلى الأنبوب الجديد سعة 1.5 ملليلتر. اجمع آخر مخزن مؤقت للتدفق لإذابة التتراسيكلين.
تأكد من أن المخزن المؤقت للتجربة في المحقنة يطابق المخزن المؤقت في الخلية المرجعية. حدد تركيز الأبتامير مرة أخرى باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية المرئي. استخدم آخر مخزن مؤقت للتبادل لضبط التركيز على التتراسيكلين 40 ميكرومولار وأبتامير ثنائي الميكرومول.
قم بطي أبتامر الحمض النووي عن طريق التسخين عند 90 درجة سلزية لمدة 10 دقائق ، ثم التبريد عند أربع درجات سلزية لمدة 10 دقائق ، ثم العودة إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. قم بإزالة غاز الأبتامير المطوي والتتراسيكلين المخاطب باستخدام محطة تفريغ أو مضخة تفريغ لمدة 25 دقيقة للتخلص من الغازات المذابة. بعد تنظيف الجهاز والتأكد من نظافته ، اختبر دقة الجهاز باستخدام مجموعة قياسية تتضمن EDTA وكلوريد الكالسيوم باستخدام البرنامج الافتراضي واتباع التعليمات من الشركة المصنعة.
قم بإعداد المعلمات قيد التشغيل. تحقق من وحدات التخزين المطلوبة باستخدام آلة حاسبة للبرنامج قيد التشغيل. باستخدام معلمة التشغيل هذه ، قم بإجراء قياس ITC باستخدام 230 ميكرولتر من التتراسيكلين 40 ميكرومولار في حقنة ITC و 485 ميكرولتر من الأبتامير ثنائي الميكرومولار في خلية عينة ITC باستخدام ITC.
قم بتحميل ألواح حقنة التتراسيكلين المخزية والأبتامير المطوي في خلية العينة ، وتجنب الفقاعات ، باستخدام ماصة. ابدأ تشغيل أداة ITC بالنقر فوق الزر "ابدأ" في البرنامج. افتح برنامج تحليل البيانات بالنقر المزدوج لبدء تحليل البيانات.
افتح مسار البيانات الأولية المحفوظة لمعرفة ميل الربط. افتح علامة التبويب النمذجة واستخدم نماذج ربط مختلفة للعثور على أفضل ملاءمة لمنحنى البيانات. بعد ذلك ، يقوم البرنامج تلقائيا بحساب الرسم البياني الحراري ل ITC والمعلمات الديناميكية الحرارية المختلفة ، بما في ذلك المحتوى الحراري ، والانتروبيا ، والطاقة الحرة ، وثابت ربط التوازن ، والقياس المتكافئ.
اجمع المعلمات الديناميكية الحرارية المحددة من البيانات ومعلومات نموذج التركيب. قم بإنشاء تقرير يتضمن صورا للمخطط الحراري لمركز التجارة الدولية ومعلمات ديناميكية حرارية مختلفة. يرتبط الأبتامير الذي اختاره كيم وآخرون بالتتراسيكلين مع تقارب الارتباط لثابت الانفصال واحد يساوي 13 ميكرومولار وثابت الانفصال اثنان يساوي 53 نانومولار.
يعكس نموذج التركيب والقياس الكيميائي من ITC أن الأبتامير يرتبط بالتتراسيكلين من خلال نسبة ربط 2: 1 مع نموذج الربط المتسلسل. أشارت المعلمات الديناميكية الحرارية التي حددها قياس ITC للموقع الثاني إلى أن المحتوى الحراري الذي يتغلب على فقدان إنتروبي كبير نسبيا يقود الارتباط القوي. يرتبط الارتباط المدفوع بالمحتوى الحراري مع فقدان الإنتروبيا بالتغيرات التوافقية للحمض النووي ، والتي تم الإبلاغ عنها كسلوكيات ربط بين الحمض النووي الريبي وجزيء صغير.
يجب أن يكون الأبتامير والليجند في نفس المخزن المؤقت. يجب إعادة طي الأبتامير إذا تم تطويره مع إعادة الطي ، ويجب تفريغ العينات. ستضمن معالجة هذه الاعتبارات أن تفاعلات aptamer-ligand فقط هي التي تساهم في الإشارة المقاسة.
نظرا لحجم هدف aptamer ، يمكن أن تكون طريقة المتابعة المناسبة هي الرحلان الحراري المجهري لتأكيد تقارب الربط المقاس الخالي من المحلول.
