פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לקבוע את זיקות הקשירה של אפטמרים כנגד מטרות חופשיות בתמיסה, תוך מתן תובנה לגבי מנגנון הקשירה. מכיוון ש- ITC מודד שינויים בחום עקב קשירה, לא aptamer ולא ligand צריך להיות מתויג או פונקציונלי, כפי שהיה במקרה של טכניקות כגון SPR. משתמשים חדשים צריכים לשים לב למאגרים תואמים בכל רכיבי הכריכה.
בנוסף, שימו לב שלטכניקה יש דרישות דגימה גבוהות שעשויות להיות קשות לעמידה עבור ליגנדות גדולות יותר כגון חלבונים. כדי להתחיל, להפעיל את הממברנה של עמודת הדיאליזה, למלא עם מאגר PBS, שיווי משקל במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, צנטריפוגה ב 5, 000 פעמים G במשך 15 דקות. הסר את המאגר וטען 500 מיקרוליטר של דגימות aptamer לתוך העמודה.
צנטריפוגה ב 5, 000 פעמים G ולחזור על זה ארבע פעמים כדי להחליף את המאגר המקורי עבור PBS. לאסוף את ה- DNA aptamer dialyzed באמצעות פיפטה ולהעביר אותו לצינור החדש 1.5 מיליליטר. אסוף את מאגר הזרימה האחרון כדי להמיס טטרציקלין.
ודא שהמאגר של הניסוי במזרק תואם למאגר בתא הייחוס. קבע שוב את ריכוז האפטמר באמצעות ספקטרומטר הנראה לעין UV. השתמש במאגר החליפין האחרון כדי להתאים את הריכוז לטטרציקלין 40-מיקרומולרי ואפטמר דו-מיקרומולרי.
מקפלים את ה-DNA aptamer על ידי חימום ב-90 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, קירור ב-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולאחר מכן חוזרים לטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. דגה את האפטמר המקופל והטטרציקלין המקופל באמצעות תחנת degassing או משאבת ואקום למשך 25 דקות כדי לחסל גזים מומסים. לאחר ניקוי ואישור ניקיון המכונה, בדוק את דיוק המכונה עם ערכה סטנדרטית הכוללת EDTA וסידן כלורי באמצעות תוכנית ברירת המחדל ופעל לפי הוראות היצרן.
הגדר את הפרמטרים הפועלים. בדוק את אמצעי האחסון הדרושים באמצעות מחשבון תוכנית פועלת. עם פרמטר ריצה זה, בצע מדידת ITC עם 230 מיקרוליטרים של טטרציקלין 40-micromolar במזרק ITC ו 485 מיקרוליטר של שני מיקרומולר aptamer בתא מדגם ITC באמצעות ITC.
העמיסו את לוחות המזרק טטרציקלין המקופלים ואת האפטמר המקופל לתוך תא הדגימה, תוך הימנעות מבועות, באמצעות פיפטה. התחל להפעיל את מכשיר ה- ITC על ידי לחיצה על התחלה כפתור בתוכנה. פתח את תוכנת ניתוח הנתונים על ידי לחיצה כפולה כדי להתחיל לנתח את הנתונים.
פתח את הנתיב של הנתונים הגולמיים שנשמרו כדי לדעת את הנטייה של כריכה. פתח את הכרטיסיה מידול והשתמש במודלי איגוד שונים כדי למצוא את ההתאמה הטובה ביותר לעקומת הנתונים. לאחר מכן, התוכנה מחשבת באופן אוטומטי את התרמוגרמה של ITC ופרמטרים תרמודינמיים שונים, כולל אנתלפיה, אנטרופיה, אנרגיה חופשית, קבוע קשירה של שיווי משקל וסטויכיומטריה.
אסוף את הפרמטרים התרמודינמיים שנקבעו מהנתונים וממידע המודל המתאים. צור דוח הכולל תמונות של התרמוגרמה ITC ופרמטרים תרמודינמיים שונים. האפטמר שנבחר על ידי קים, et al נקשר לטטרציקלין עם זיקות מחייבות של קבוע דיסוציאציה אחד שווה 13 מיקרומולר וקבוע דיסוציאציה שני שווה 53 ננו-מולר.
המודל המתאים והסטויכיומטריה של ITC משקפים כי האפטמר נקשר לטטרציקלין באמצעות יחס קשירה של 2:1 עם מודל הקשירה הרציפה. הפרמטרים התרמודינמיים שנקבעו על ידי מדידת ITC עבור אתר שני הצביעו על כך שהתגברות על אנתלפיה משמעותית יחסית של אובדן אנטרופי מניעה את הקשירה החזקה. הקשירה מונעת האנתלפיה עם אובדן האנטרופיה מתייחסת לשינויים קונפורמיים של חומצות גרעין, שדווחו כהתנהגויות קשירה בין רנ"א למולקולה קטנה.
האפטמר והליגנד חייבים להיות באותו חיץ. יש לקפל מחדש את האפטאמר אם פותח עם refolding, ודגימות חייבות להיות degassed. טיפול בשיקולים אלה יבטיח שרק אינטראקציות אפטמר-ליגנד יתרמו לאות הנמדד.
בשל גודלו של יעד האפטמר, שיטת מעקב מתאימה יכולה להיות תרמופורזה בקנה מידה זעיר כדי לאשר את זיקת הקשירה הנמדדת ללא תמיסה.
