سيساعد هذا البروتوكول الباحثين الجدد في العمل مع aptamers ليكونوا قادرين على استخدامها في مشاريعهم وأيضا لفهم الخطوات الصغيرة الفردية المطلوبة لإكمال البروتوكول. الأبتامرز متعدد الاستخدامات للغاية ، ويوضح هذا البروتوكول مدى سهولة وبساطة اختبار التنميط المناعي. يمكن استخدام Aptamers لكل من التطبيقات التشخيصية والعلاجية.
هذا البروتوكول هو الخطوات الأولى المتخذة لتأكيد خصوصيتها وحساسيتها. في حين أن هذا الفحص الخاص يوضح تلطيخ مستقبل سطح خلية واحدة ، يمكن بسهولة استخدام الأبتامير لقياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات ، مما يوفر مستوى عال من المعرفة المظهرية. تتمثل الجوانب المهمة للعمل مع الأبتامير في ضمان طيها بشكل صحيح قبل الاستخدام ، وكذلك أن ظروف المخزن المؤقت والقوة الأيونية هي نفسها عند اختيارها.
بعد جمع الوسائط والتخلص منها في القارورة ، أضف ثلاثة ملليلتر من PBS وانشرها على الخلايا. بعد إضافة ملليلتر واحد من 0.25٪ من Trypsin-EDTA إلى كل قارورة ، احتضن لمدة خمس إلى 10 دقائق عند 37 درجة مئوية وتصور انفصال الخلايا تحت المجهر. بعد ذلك ، أضف ملليلترا واحدا من الوسط الكامل إلى الخلايا وماصة الخلايا لأعلى ولأسفل لعمل تعليق خلية واحدة.
ماصة الخلايا في أنبوب مناسب وأجهزة طرد مركزي في 200 غرام لمدة خمس دقائق. بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من الوسط الطازج وعد الخلايا باستخدام تلطيخ التريبان الأزرق عن طريق تخفيف حجم معين من تعليق الخلية باستخدام التريبان الأزرق. توزيع ما يقرب من 15 ميكرولتر من الخليط بين مقياس الدم وغطاء زجاجي لحساب الخلايا.
اجمع العدد المطلوب من الخلايا ، وتأكد من وجود مائة ألف خلية لكل عينة اختبار. ثم احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين للسماح بتثبيت البروتين محل الاهتمام على غشاء الخلية بعد الانفصال الأنزيمي. بعد ساعتين من الحضانة ، قم بطرد الخلايا بالطرد المركزي عند 500 غرام لمدة خمس دقائق.
بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحظر. احتضان الخلايا عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة مع الخلط المتقطع. خلال هذه الحضانة التي تستغرق 30 دقيقة ، قم بإجراء طي الأبتامير عن طريق تحضير ضعف تركيزات الأبتامير كما هو موضح في المخطوطة.
ثم قم بخلط واحتضان الأبتامير مع آلة التدوير الحراري وفقا لظروف الطي المطلوبة مع ضمان حماية الأبتامير من الضوء. بعد الحضانة لمدة 30 دقيقة ، قم بالطرد المركزي للخلايا كما هو موضح سابقا وإزالة المادة الطافية. ثم أضف ملليلتر واحد من محلول الغسيل والطرد المركزي للخلايا مرة أخرى.
بعد إزالة المادة الطافية ، أعد تعليق الخلايا في حجم مناسب من المخزن المؤقت للربط. بعد ذلك ، ماصة 50 ميكرولتر من الخلايا المعاد تعليقها في كل بئر من الجليد البارد 96 صفيحة سوداء جيدة. ثم ماصة 50 ميكرولتر من الأبتامير على حجم 50 ميكرولتر من الخلايا ، وتخلط وتحتضن في الظلام عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
بعد الطرد المركزي وإزالة المادة الطافية ، أعد تعليق الحبيبات بعناية في محلول الغسيل ومرة أخرى أجهزة الطرد المركزي عند 500 جم لمدة خمس دقائق. ثم أعد التعليق في 100 ميكرولتر من مخزن الغسيل المؤقت لتحليل التدفق الخلوي مع تكرار خطوة الغسيل مرتين. أولا ، قم بتشغيل مقياس التدفق الخلوي ثم الكمبيوتر.
بعد ذلك ، افتح برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي ، وقم بتسجيل الدخول إلى البرنامج ، وتحت علامة التبويب مقياس الخلايا ، قم بتشغيل بدء تشغيل السوائل. لإنشاء تجربة جديدة، ضمن علامة التبويب تجربة، انقر فوق مجلد جديد، وقم بتسمية تجربة شرطة مائلة للمجلد بشكل مناسب. انقر فوق المجلد الجديد لتمييزه.
ثم ضمن علامة التبويب التجربة مرة أخرى، انقر على تجربة جديدة وقم بتسمية التجربة بشكل مناسب. لإضافة عينة الشرطة المائلة الأولى، ضمن علامة التبويب التجربة، انقر فوق عينة جديدة وقم بتسمية العينة بشكل مناسب. لإضافة عينة أنبوب، قم بتمييز العينة وضمن علامة التبويب التجربة، انقر فوق أنبوب جديد.
ثم أضف العدد المناسب من الأنابيب والاسم. لإعداد الرسوم البيانية المطلوبة، ضمن علامة تبويب ورقة عمل، افتح ورقة عمل جديدة. بمجرد ظهور نافذة ورقة العمل الجديدة ، قم بإعداد رسم بياني لطخة نقطية للتشتت الجانبي مقابل التشتت الأمامي لتحديد السكان محل الاهتمام.
قم بإعداد رسم بياني للبقع النقطية لارتفاع التشتت الأمامي مقابل منطقة التشتت الأمامي لتحديد مجتمع الخلية المفردة. بعد ذلك ، قم بإعداد رسم بياني لعدد الأحداث مقابل الفلوروفور محل الاهتمام. تأكد من أن لوحة معلومات الاستحواذ للتحكم في الحصول على العينة والمفتش ومقياس الخلايا لضبط معلمات الجهد بالإضافة إلى ورقة العمل مع جميع الرسوم البيانية مفتوحة قبل بدء قياس التدفق الخلوي.
أولا ، قم بتشغيل الخلايا غير المعالجة. تأكد من أن السهم الذي يشير إلى الأنبوب أخضر. إذا لم يكن هذا السهم أخضر ، فانقر فوق السهم لجعله أخضر.
باستخدام ماصة ، انقل كل عينة من اللوحة السوداء 96 إلى أنبوب قياس التدفق الخلوي. في لوحة معلومات الاستحواذ، اختر عددا مناسبا من الأحداث لتسجيلها، وقم بتغيير معدل التدفق إلى منخفض، وانقر فوق الحصول على البيانات. اضبط الجهد لمعلمات FSC و SCC ، مما يضمن أن عدد الخلايا مركزي داخل مخطط النقاط وأنه لا توجد خلايا تلمس أي من محوري الرسم البياني لتجنب فقدان الخلايا ذات الاهتمام.
حدد البوابة الأولى من خلال تحديد واختيار السكان المعنيين في مخطط كثافة مبعثرة أمامية وجانبية مع استبعاد الحطام ، الذي يشكل السكان الذين لديهم أدنى إشارة تشتت أمامية. حدد البوابة الثانية عن طريق استبعاد مجموعات الخلايا المزدوجة ، حيث تؤثر الخلايا المزدوجة بشكل كبير على النتائج والاستنتاجات. قم بزيادة سرعة الاكتساب إلى متوسطة أو عالية لتحليل العينات بشكل أسرع ، ولكن لا تتجاوز أكثر من 200 إلى 300 حدث في الثانية.
ثم انقر فوق تسجيل البيانات. بعد ضبط الجهد والبوابات وتسجيل البيانات ، أخرج العينة وانقر فوق Next Tube. أدخل العينة التالية وكرر بيانات التسجيل لجميع عينات التحكم والاختبار.
بمجرد جمع جميع البيانات ، اغسل مقياس التدفق الخلوي عن طريق تشغيل ثلاثة أنابيب من المبيض بنسبة 50٪ و FACSRinse والمياه فائقة النقاء ، كل منها لمدة خمس دقائق بمعدل تدفق مرتفع. ثم من القائمة المنسدلة لمقياس الخلايا ، انقر فوق إيقاف تشغيل fluidics. قم بتصدير النتيجة كملفات fsc إلى محرك أقراص USB لنقلها.
قم بتحليلها باستخدام برنامج التحليل بالضغط على الزر الجديد لإنشاء مستند جديد ونافذة للتعامل مع التحليل ، واسحب ملفات العينة إلى النافذة الجديدة. انقر نقرا مزدوجا لفتح العينة غير الملوثة. لبوابة مجتمع الخلية المفردة ، اختر مجتمع P1 وانقر نقرا مزدوجا فوق مجتمع P1 لإنشاء رسم بياني FSCH مقابل FSCA.
انقر نقرا مزدوجا فوق الخلايا المفردة المسورة لإنشاء مدرج تكراري للأحداث مقابل الفلوروكروم المستخدم. في النافذة الأصلية ، حدد P1 والخلايا المفردة واسحبها إلى جميع العينات بحيث تحتوي جميع العينات الآن على نفس البوابة. بعد ذلك ، انقر فوق زر محرر التخطيط لفتح نافذة التخطيطات واسحب عينتين فوق بعضهما البعض لإنشاء مدرج تكراري متراكب.
في خلايا EpCAM الإيجابية MDA-MB-231 ، يظهر تراكب الرسوم البيانية التي تمثل الخلايا المعالجة ب TEPP و TENN أن الخلايا المعالجة ب TEPP يتم إزاحتها إلى اليمين ، مقارنة بالخلايا المعالجة ب TENN مما يدل على أن ارتباط أبتامير TEPP يحدث للبروتين محل الاهتمام. في التحكم السلبي ، لا تعكس خلايا HEK 293T المتراكبة على الرسوم البيانية ل TEPP و TENN أي تحول يشير إلى أنه في خلايا التعبير عن EpCAM TEPP هو أبتامير EpCAM المرتبط بمستقبلاته. علاوة على ذلك ، لم يلاحظ أي ارتباط في الخلايا السلبية EpCAM ، مما يؤكد انتقائية وخصوصية الأبتامير المطور.
تأكد من حماية الأبتامير من الضوء ، وخلط الأبتامير والخلايا على اللوحة ، وضبط الفولتية الصحيحة على مقياس التدفق الخلوي. هذا يعتمد بشكل كبير على التطبيقات المستقبلية ل aptamers. على سبيل المثال ، نحن نركز على توصيل الدواء.
لذا فإن الخطوة التالية بالنسبة لنا هي تقييم ما إذا كانت الأبتامير داخلية باستخدام المجهر الفلوري. أظهر هذا البروتوكول مدى سهولة استبدال الأبتامير بالأجسام المضادة وحيدة النسيلة ومتعددة النسيلة في مقايسات التنميط المناعي.
