Pyrosequencing هو تسلسل بواسطة تقنية التوليف التي يمكن استخدامها للنمط الجيني لتعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة في الحمض النووي للميتوكوندريا. هذه الطريقة مفيدة في سهولة التنفيذ والفعالية من حيث التكلفة عند مقارنتها بطرق التسلسل الأخرى. يمكن استخدامه بسهولة كطريقة تشخيصية لبعض أمراض الميتوكوندريا عن طريق تحديد قيم المغايرة للمتغيرات المسببة للأمراض في الحمض النووي للميتوكوندريا.
للبدء ، احصل على ملف تسلسل الحمض النووي للميتوكوندريا للأنواع التي يتم تصنيفها وراثيا وحدد موضع تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة ، أو SNP. تأكد من أن التسلسل المرجعي المستخدم يستخدم الترقيم الأساسي المناسب للطفرة المدروسة بحيث يمكن تحديد موضع SNP بسهولة. انسخ 1،000 زوج أساسي في المنبع والمصب لموقع SNP والصق التسلسل المقطوع في برنامج تصميم التمهيدي pyrosequencing.
قم بتمييز القاعدة متعددة الأشكال ، وانقر بزر الماوس الأيمن فوقها ، ثم حدد تعيين المنطقة المستهدفة لتعيين قاعدة SNP التي تم تحليلها كهدف لمقايسة pyrosequencing. اضغط على أيقونة التشغيل في الزاوية اليمنى العليا من الواجهة لبدء اختيار التمهيدي ، وانتظر حتى يقوم البرنامج تلقائيا بإنشاء ثلاثيات التمهيدي ، واثنين من البادئات للتضخيم المسبق للقالب DNA ، والتمهيدي الثالث للتسلسل بواسطة التوليف في آلة pyrosequencing. انقر بزر الماوس الأيمن وحدد نسخ كافة مجموعات التمهيدي للاحتفاظ بجميع مجموعات التمهيدي.
افتح برنامج التشغيل المزود مع جهاز التسلسل الحراري، وحدد فحص جديد، ثم حدد قالب مقايسة القياس الكمي للأليت. أدخل التسلسل المراد تحليله في المربع المقابل عن طريق كتابة النيوكليوتيدات مباشرة في اتجاه مجرى التسلسل التمهيدي. بالنسبة للموضع المتغير ، أشر إلى القاعدتين المحتملتين ، مفصولتين بشرطة مائلة.
اضغط على إنشاء أمر الاستغناء ، ودع البرنامج يحدد تلقائيا ترتيبا مناسبا للنيوكليوتيدات التي سيتم الاستغناء عنها في التسلسل عن طريق تفاعل التوليف. حفظ ، وتقديم اسم للفحص. بعد ذلك ، قم بتنفيذ الجري عن طريق تخفيف الحمض النووي المراد تحليله إلى 5 نانوجرام لكل ميكرولتر.
في الجولة الأولى ، تأكد من تضمين عينات من التغاير المعروف كمرجع وعينات من النوع البري. ثم قم بإجراء تسلسل PCR من 5 ميكرولتر من الحمض النووي المخفف وتفاعلات 25 ميكرولتر ، باستخدام بادئات التضخيم والمعلمات. لتشغيل إعداد الملف، حدد تشغيل جديد في برنامج التسلسل الحراري.
يمكن لجهاز التسلسل الحراري تسلسل 48 تفاعلا مسبقا منفصلا في وقت واحد مع مربع فارغ يمثل بئر تسلسل واحد على قرص pyrosequencing. قم بتحميل المقايسات بالنقر بزر الماوس الأيمن على مربع وتحديد تحميل الفحص. إذا لزم الأمر ، قم بتسلسل ما يصل إلى أربعة مقايسات منفصلة مع بادئات تسلسل مختلفة.
اضبط وضع توزيع التمهيدي على تلقائي لتعيين غرفة حقن تلقائيا لكل برايمر تسلسل يستخدم للتشغيل. اضبط وضع التشغيل على قياسي ، ما لم يتم تشغيل أربعة أنواع مختلفة من المقايسات على قرص تسلسل واحد. تأكد من أن عدد المقايسات في ملف قالب التشغيل يطابق عدد تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل التي يتم تضخيمها.
ثم احفظ ملفات التشغيل على محرك أقراص USB. لتجهيز جهاز التسلسل الحراري ، اضغط على زر التنظيف على شاشة اللمس الرئيسية للجهاز وقم بتنظيف جميع الحاقنات بماء عالي النقاء ، باتباع الإرشادات التي تظهر على الشاشة. عند إدخال شريط الامتصاص في الماكينة ، تأكد من التقاء الأطراف في وضع الساعة 9.
بعد توصيل محرك أقراص USB ، اضغط على الزر Sequence لتحميل ملفات التشغيل المعدة مسبقا. اتبع التعليمات الموجودة على الجهاز لتحميل الكواشف وتجهيزها ، كما هو مطلوب ، في الحاقنات المقابلة على الجهاز. قم بتحميل 3 ميكرولتر من الخرز في الآبار ، ثم قم بتحميل 10 ميكرولتر من كل تفاعل PCR ليتم تسلسلها في العينة المقابلة.
ماصة لأعلى ولأسفل لخلط العينة مع الخرز المغناطيسي. ابحث عن الإشارة في جهاز التسلسل الحراري المعد إلى أنه يمكن تحميل القرص في الجهاز. قم بفك صامولة تثبيت اللوحة ، وقم بمحاذاة لوحة العينة المحملة مع الدبوس المعدني في حجرة القرص.
بمجرد تثبيت اللوحة بإحكام في حجرة اللوحة ، قم بتشغيل تشغيل التسلسل بالضغط على زر البدء في واجهة الشاشة التي تعمل باللمس. بمجرد اكتمال التشغيل ، قم بإزالة محرك أقراص USB من الجهاز ، وقم بتوصيله مرة أخرى بالكمبيوتر الذي يقوم بتشغيل برنامج pyrosequencer. بعد ظهور ملف التشغيل الذي تم إنشاؤه حديثا على محرك أقراص USB ، انقر نقرا مزدوجا فوق ملف Run Result.
يحلل هذا تلقائيا ناتج لوسيفيراز لكل بئر عند دمج النوكليوتيدات ، ويحدد أليل الميتوكوندريا محل الاهتمام. ابحث عن درجات الألوان التي يعرضها البرنامج بناء على جودة القراءات. لحفظ النتائج ، حدد التقارير في النافذة العلوية ، متبوعة بالتقرير الكامل لإنشاء ملف PDF يحتوي على البيروجرامات والنتائج من كل بئر من التشغيل.
بدلا من ذلك، يمكنك تنزيل النتائج بتنسيقات أخرى ضمن علامة التبويب التقارير. الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بادئات التضخيم من كلتا المجموعتين المختارتين لطفرة m. 3243A>G كما هو موضح في هذا الشكل.
هنا ، يشير Het إلى عينة m. 3243A>G المتجانسة تقريبا المراد تحليلها. تظهر مقارنة بين أداء كلتا المجموعتين التمهيديتين باستخدام المعايير المولية للمعايرة في هذا الشكل.
يتم الإشارة إلى القيم المقاسة بالخطوط الرأسية المنقطة. يتم عرض دالة خطية X = Y لتوضيح مدى قرب كل من المقايستين المختبرتين من القياس المثالي. أسماء خطوط الخلايا على المحور X هي أسماء الحيوانات المستنسخة السايبريدية المختلفة التي تم تصنيفها وراثيا باستخدام هذا الفحص.
نتائج التنميط الجيني على أربعة مستنسخات سايبريد غير معروفة m. 3243A>G heteroplasmy باستخدام كلا المقايسات موضحة هنا. تم إجراء التسلسل في ثلاث نسخ تقنية.
نتائج التنميط الجيني للخلايا المعالجة بنوكلياز إصبع الزنك الميتوكوندريا ، جنبا إلى جنب مع الضوابط غير المعالجة والمعالجة الوهمية ، والبيروجرامات من اثنين من عينات خلايا MEF PCR المستخدمة لتوليد النتائج بالإضافة إلى التحكم في التنميط الجيني من النوع البري موضحة هنا. يمكن استخدام Pyrosequencing كقراءة لتجارب العلاج الجيني لتقييم تقنيات العلاج الجيني المختلفة في الحمض النووي للميتوكوندريا.
