Le pyroséquençage est un séquençage par technique de synthèse qui peut être utilisé pour génotyper des polymorphismes mononucléotidiques dans l’ADN mitochondrial. Cette méthode est avantageuse par sa facilité de mise en œuvre et son rapport coût-efficacité par rapport à d’autres méthodes de séquençage. Il peut facilement être utilisé comme méthode de diagnostic pour certaines maladies mitochondriales en déterminant les valeurs d’hétéroplasmie de variantes pathogènes dans l’ADN mitochondrial.
Pour commencer, obtenez un fichier de séquence d’ADN mitochondrial pour l’espèce en cours de génotypage et identifiez la position du polymorphisme mononucléotidique, ou SNP. S’assurer que la séquence de référence utilisée utilise la numérotation de base appropriée pour la mutation étudiée afin que la position du SNP puisse être facilement identifiée. Copiez 1 000 paires de bases en amont et en aval du site SNP et collez la séquence tronquée dans le logiciel de conception d’amorces pyroséquençage.
Mettez en surbrillance la base polymorphe, cliquez dessus avec le bouton droit, puis sélectionnez Définir la région cible pour définir la base SNP analysée comme cible du test de pyroséquençage. Appuyez sur l’icône Play dans le coin supérieur droit de l’interface pour lancer la sélection d’amorces et attendez que le logiciel génère automatiquement les trios d’amorces, deux amorces pour la préamplification de l’ADN du modèle et la troisième amorce pour le séquençage par synthèse dans la machine de pyroséquençage. Cliquez avec le bouton droit de la souris et sélectionnez Copier tous les jeux d’amorces pour conserver tous les jeux d’amorces.
Ouvrez le logiciel d’exécution fourni avec le pyroséquenceur, sélectionnez Nouveau test, puis sélectionnez le modèle d’essai de quantification des allèles. Entrez la séquence à analyser dans la case correspondante en tapant les nucléotides directement en aval de l’amorce de séquençage. Pour la position variable, désignez les deux bases possibles, séparées par une barre oblique.
Appuyez sur Generate Dispensation Order (Générer l’ordre de dispensation) et laissez le logiciel déterminer automatiquement un ordre approprié pour les nucléotides à distribuer dans le séquençage par réaction de synthèse. Enregistrez et donnez un nom au test. Ensuite, exécutez l’exécution en diluant l’ADN à analyser à 5 nanogrammes par microlitre.
Lors de la première exécution, assurez-vous d’inclure des échantillons d’hétéroplasmie connue comme référence et des échantillons de type sauvage. Effectuez ensuite une PCR de préséquençage de 5 microlitres d’ADN dilué et de 25 microlitres de réactions, en utilisant les amorces et les paramètres d’amplification. Pour exécuter la configuration du fichier, sélectionnez Nouvelle exécution dans le logiciel pyroséquence.
Le pyroséquenceur peut séquencer simultanément 48 réactions préamplifiées distinctes avec un carré vide représentant un seul puits de séquençage sur un disque de pyroséquençage. Chargez les tests en cliquant avec le bouton droit de la souris sur un carré et en sélectionnant Load Assay. Si nécessaire, séquencez jusqu’à quatre essais distincts avec différentes amorces de séquençage.
Réglez le mode de distribution de l’amorce sur automatique pour attribuer automatiquement une chambre d’injection pour chaque amorce de séquençage utilisée pour l’exécution. Définissez le mode d’exécution sur standard, sauf si vous exécutez quatre types de tests différents sur un disque de séquençage. Assurez-vous que le nombre de tests sur le fichier de modèle d’exécution correspond au nombre de réactions PCR amplifiées.
Enregistrez ensuite les fichiers d’exécution sur une clé USB. Pour amorcer le pyroséquenceur, appuyez sur le bouton de nettoyage de l’écran tactile principal de l’appareil et nettoyez tous les injecteurs avec de l’eau de haute pureté, en suivant les instructions à l’écran. Lors de l’insertion de la bande absorbante dans la machine, assurez-vous que les extrémités se rencontrent en position 9 heures.
Après avoir branché la clé USB, appuyez sur le bouton Séquence pour charger les fichiers d’exécution préparés précédemment. Suivez les instructions sur l’appareil pour charger et amorcer les réactifs, au besoin, dans les injecteurs correspondants sur la machine. Chargez 3 microlitres de billes dans les puits, puis chargez 10 microlitres de chaque réaction PCR à séquencer dans l’échantillon correspondant.
Pipeter de haut en bas pour mélanger l’échantillon avec les billes magnétiques. Recherchez l’indication dans le pyroséquenceur amorcé que le disque peut être chargé dans la machine. Dévissez l’écrou de maintien de la plaque et alignez la plaque d’échantillon chargée avec la goupille métallique dans le compartiment à disque.
Une fois la plaque fermement vissée dans le compartiment de la plaque, lancez l’exécution du séquençage en appuyant sur le bouton de démarrage de l’interface de l’écran tactile. Une fois l’exécution terminée, retirez la clé USB de la machine et rebranchez-la sur l’ordinateur exécutant le logiciel pyroséquenceur. Une fois que le fichier d’exécution nouvellement généré apparaît sur le lecteur USB, double-cliquez sur le fichier de résultat de l’exécution.
Cela analyse automatiquement la sortie de luciférase de chaque puits lors de l’incorporation de nucléotides et quantifie l’allèle mitochondrial d’intérêt. Recherchez les scores de couleur affichés par le logiciel en fonction de la qualité des lectures. Pour enregistrer les résultats, sélectionnez Rapports dans la fenêtre supérieure, puis Rapport complet pour générer un fichier PDF contenant les pyrogrammes et les résultats de chaque puits de l’essai.
Vous pouvez également télécharger les résultats dans d’autres formats sous l’onglet Rapports. Électrophorèse sur gel d’agarose d’une amplification PCR utilisant les amorces d’amplification des deux ensembles sélectionnés pour la mutation m. 3243A>G comme indiqué sur cette figure.
Ici, Het désigne l’échantillon m. 3243A>G presque homoplasmique à analyser. Une comparaison de la performance des deux ensembles d’amorces utilisant des étalons molaires pour l’étalonnage est présentée dans cette figure.
Les valeurs mesurées sont indiquées par les lignes pointillées verticales. Une fonction linéaire X=Y est affichée pour illustrer à quel point chacun des deux tests testés est proche d’une mesure idéale. Les noms des lignées cellulaires sur l’axe des X sont les noms des différents clones de cybride qui ont été génotypés à l’aide de ce test.
Les résultats du génotypage sur quatre clones de cybride d’hétéroplasmie m. 3243A>G inconnue à l’aide des deux tests sont présentés ici. Le séquençage a été effectué en triplat technique.
Les résultats du génotypage des cellules traitées par nucléase mitochondriale à doigt de zinc, ainsi que des témoins non traités et simulés, et les pyrogrammes de deux réplicas PCR d’échantillons de cellules MEF utilisés pour générer les résultats ainsi que le contrôle du génotypage de type sauvage sont présentés ici. Le pyroséquençage peut être utilisé comme lecture pour des expériences de thérapie génique visant à évaluer diverses technologies de thérapie génique dans l’ADN mitochondrial.
