يوفر هذا البروتوكول مرجعا موثوقا لإعداد معلق عالي الجودة أحادي الخلية من أمعاء البلطي النيلي لتسهيل الدراسات على مستوى الخلية الواحدة في أنواع أسماك الاستزراع المائي. التكنولوجيا عالية الكفاءة ويمكن تنفيذها في معظم ظروف المختبر. وهو يقلل من الحاجة إلى تجارب إضافية لإعداد معلقات وحيدة الخلية لأنواع أسماك الاستزراع المائي.
ابدأ بشطف أسماك البلطي النيلي البالغة من العمر ستة أشهر في ماء معقم جيد التهوية لمدة 15 دقيقة لغسل البكتيريا غير المرتبطة من السطح. لتحضير كاشف تفكك الخلايا الأنزيمية ، قم بتخفيف كولاجيناز ديسباز في برنامج تلفزيوني إلى تركيز نهائي قدره ملليغرام واحد لكل ملليلتر. امزج 95٪ حجم من المحلول الأنزيمي المحضر و 5٪ حجم FBS.
ثم قم بتبريد جهاز الطرد المركزي مسبقا إلى أربع درجات مئوية قبل الاستخدام. لتشريح الأنسجة ، ضع السمك الرحيم على الجليد واجمع ثلاثة إلى أربعة سنتيمترات من منتصف الأمعاء. استئص الدهون والمساريق باستخدام الملقط.
إزالة الدهون تعلق على سطح الأمعاء والغشاء المخاطي واضحة مرنة ومرنة. شطف بلطف جزء الأمعاء مع برنامج تلفزيوني بارد الجليد المعقم باستخدام حقنة لغسل محتويات الأمعاء والمخاط. بعد عدة غسلات ، قم بتشريح الجزء إلى قطع صغيرة ونقلها إلى أنبوب سعة 1.5 ملليلتر يحتوي على ملليلتر واحد من الجليد البارد PBS.
الطرد المركزي الخليط في 300 × غرام في أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. واستبدل المادة الطافية بمليلتر واحد من الثلج البارد 0.08٪ BSA-DPBS. باستخدام ماصة زجاجية نضح بلطف لإعادة تعليق شظايا الأنسجة.
بعد غسل القطع مرة أخرى ، قم بإزالة المادة الطافية وإضافة ملليلتر واحد من كاشف التفكك الأنزيمي المحضر. قم أيضا بخلط خمسة ميكرولترات من مثبطات الحمض النووي الريبي مع كاشف التفكك لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية. ضع الأنبوب في حمام مائي مقسى 37 درجة مئوية واقلب الأنبوب يدويا كل خمس دقائق خلال فترة الحضانة من 30 إلى 60 دقيقة.
بمجرد تدوير الأنابيب ، قم بإزالة كاشف تفكك الخلايا الأنزيمية باستخدام أطراف واسعة التجويف. أضف ملليلتر واحد من الثلج البارد 0.08٪ BSA-DPBS وقم بامتصاص الخلايا برفق لأعلى ولأسفل لمنع تعطل الخلايا. بعد الانصهار المركزي وتعليق الخلايا مرة أخرى ، ضع مصفاة الخلايا 40 ميكرومتر مبللة مسبقا بنسبة 0.08٪ BSA-DPBS على أنبوب مخروطي 50 ملليلتر.
مرر تعليق الخلية من خلال المصفاة. اضغط على المصفاة ، ثم اشطفها ب 200 ميكرولتر DPBS واجمع التعليق في أسفل الأنبوب. بعد نقل التعليق إلى أنبوب سعة 1.5 ملليلتر ، أضف خمسة ميكرولترات من الحمض النووي واحتضن التعليق لمدة 15 دقيقة عند 15 إلى 20 درجة مئوية.
بمجرد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الخلية في 400 ميكرولتر من DPBS البارد المثلج بدون أيونات الكالسيوم والمغنيسيوم. ثم ماصة بلطف صعودا وهبوطا مع نصائح واسعة التجويف لخلط الخلايا وتكرار هذه العملية مرة أخرى. للتلطيخ ، قم بخلط تعليق الخلية في محلول أزرق 0.4٪ بنسبة متساوية واحتضانه لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة.
ثم أضف 10 ميكرولتر من الخليط على الشريحة الزجاجية. عد الخلايا القابلة للحياة والميتة تحت المجهر في ثلاثة حقول واحسب نسبة بقاء الخلية. تمت مقارنة كفاءات التفكك للعديد من الإنزيمات شائعة الاستخدام.
تم التحقق من أن مزيج كولاجيناز ديسباز له تأثير تفكك أفضل من كولاجيناز ديسباز أو تربسين وحده والعديد من مخاليط الإنزيم الأخرى. أظهر الفحص المجهري أن الخلايا المعوية تتمتع بقدرة عالية على البقاء ومشتتة كخلايا مفردة. كانت معظم الخلايا قابلة للحياة ، في حين أن القليل منها كان ملطخا ميتا بسبب غشاء الخلية المتغلغل.
انتبه إلى نوع برنامج تلفزيوني المستخدم. لا يمكن استخدام محلول الهضم الأنزيمي مع برنامج تلفزيوني خال من الكالسيوم / المغنيسيوم لأن الإنزيم يتطلب أيونات الكالسيوم / المغنيسيوم ليعمل بفعالية. يسهل الإجراء الدراسات على مستوى الخلية الواحدة في أنواع أسماك الاستزراع المائي مما يوفر مرجعا قيما لتطوير بروتوكولات تفكك الخلايا لأنواع أسماك الاستزراع المائي.
