يمكن لتحليل Transcriptome على خلية واحدة أو أنواع الخلايا الكشف عن الاختلاف الدقيق في التعبير الجيني الذي يتم حجبه من خلال عدم التجانس ، وهو أداة قوية للكشف عن الآليات التنظيمية المعقدة داخل الخلايا. يمكن إجراء فرز الخلايا المنشط بالفلورة متبوعا بتحليل RN-seq إما في وضع نوع الخلية المفردة أو السائبة مع حساسية عالية للكشف عن النسخ والتوافق مع الأساليب المتعددة الأوميك الأخرى. يحتاج مستخدمو هذا البروتوكول لأول مرة إلى الانتباه إلى بعض الخطوات في فرز البروتوبلاست وإعداد مكتبة RNA-seq.
جنبا إلى جنب مع جون تشانغ ، سيساعد الدكتور رونغرونغ شيه ، وهو باحث ما بعد الدكتوراه في مختبرنا ، في توضيح الإجراء. للبدء ، ضع نوع Arabidopsis thaliana البري وبذور خط علامة الفلورسنت في 20٪ مبيض واحتضانها باستخدام حاضنة دوارة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة لتعقيم البذور. أثناء العمل على مقعد معقم ، اشطف البذور ثلاث إلى خمس مرات في ماء مقطر مزدوج.
طبق النوع البري وبذور خط المراسل على وسط MS نصف القوة بوزن 0.8٪ لكل حجم أجار. طبقي النباتات لمدة يومين عند أربع درجات مئوية. ثم قم بزراعتها عموديا لمدة خمسة أيام عند 23 درجة مئوية تحت ضوء 16 ساعة ودورات مظلمة لمدة 18 ساعة.
قم بإذابة محاليل البروتوبلاستيد المشار إليها باسم المحلول (أ) والمحلول (ب) برفق على الجليد قبل التجربة. اقطع الجذور من النباتات باستخدام شفرة أو مقص نظيف واقطع الجذور إلى قطع 0.5 سم تقريبا. اغمر الجذور المفرومة في 1.5 ملليلتر من المحلول B متبوعا بدوران لطيف في درجة حرارة الغرفة لمدة 1.5 إلى 2 ساعة.
قم بتصفية البروتوبلاستيدات الجذرية الناتجة من خلال شبكة مصفاة 40 ميكرون وشطف الشبكة بواحد إلى ملليلتر من المحلول A.Centrifuge الترشيحات المدمجة عند 300 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 500 إلى 600 ميكرولتر من المحلول أ ، وضعها على الثلج على الفور. لفرز الخلايا ، انقل محلول الخلية المعاد تعليقه إلى أنبوب اختبار جديد سعة خمسة ملليلترات.
املأ خزان سائل الغمد وافحص خزان النفايات. ثم قم بتشغيل فرز الخلايا المنشط بالفلورة أو جهاز FACS. نفذ خطوات إعداد الجهاز والمعايرة التلقائية على جهاز الفرز.
حدد قنوات التألق واستخدم نباتا من النوع البري بدون مضان كعنصر تحكم أساسي. اضبط بوابة الفرز بناء على شدة التألق ومفردات التشتت الأمامية والتشتت الجانبي. بعد إضافة 500 ميكرولتر من المحلول A في أنبوب تجميع سعة 1.5 ملليلتر ، ابدأ في الفرز وجمع 2،000 إلى 3،000 خلية لكل أنبوب.
بعد الفرز ، ضع العينات على الجليد على الفور. جهاز الطرد المركزي أنبوب التجميع الذي يحتوي على الخلايا عند 300 جم وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق وإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة. خذ ميكرولتر من الخلايا المصنفة وتحقق من التألق باستخدام مجهر مضان.
قم بتخزين الخلايا التي تم فرزها عند درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر إذا لم يتم استخدامها على الفور. لفرز مؤشر الخلية الواحدة ، ضع لوحة 96 بئرا مع غشاء في المحول. قم بمعايرة موضع اللوحة بحيث تسقط القطرة في الفتحة المركزية للوحة.
قم بإزالة الغشاء من لوحة 96 بئرا وضع لوحة 96 بئرا في المحول. حدد وضع فرز خلية واحدة عند الفرز. أدخل العدد المستهدف للخلايا التي تم فرزها كخلية واحدة وابدأ الفرز.
قبل البدء في التجربة ، قم بتنظيف المقعد باستخدام مطهر سطحي و 75٪ إيثانول. استخدم جميع المعدات فقط لإعداد تسلسل المكتبة. بعد إضافة ميكرولتر واحد من الخليط الطازج A إلى العينة التي تم فرزها ، قم بطحنها بمدقة معقمة.
باستخدام الماء الخالي من الحمض النووي الريبي ، اجعل الحجم 14 ميكرولتر. ثم انقل كل عينة إلى أنبوب PCR رقيق الجدران سعة 0.2 ملليلتر. ثم تحضير الخليط B.أضف 4.4 ميكرولتر في الخليط B إلى كل أنبوب PCR يحتوي على عينات واخلطها عن طريق سحب لطيف.
احتضان العينات عند 72 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. بعد الحضانة ، ضع العينات على الفور على الجليد لتهجين oligo dT إلى ذيل poly-A. تحضير خليط تفاعل النسخ العكسي أو الخليط C في 21.6 ميكرولتر منه لكل أنبوب يحتوي على العينات.
إخضاع العينات لتفاعل النسخ العكسي في أداة تفاعل البوليميراز المتسلسل الشائعة وفقا لبرنامج النسخ العكسي. أضف 40.8 ميكرولترا من خليط تفاعل التضخيم المسبق المحضر حديثا أو الخليط D إلى منتج تفاعل النسخ العكسي وقم بتشغيل برنامج التضخيم المسبق. يمكن تحديد دورة التضخيم بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي عندما يدخل التفاعل المرحلة الأسية.
لتنقية منتجات تفاعل التضخيم المسبق ، انقل المنتجات المضخمة مسبقا من أنبوب PCR إلى أنبوب 1.5 ملليلتر. أضف 48 ميكرولترا من حبات AMPure XP إلى كل عينة واخلطها برفق عن طريق السحب قبل الحضانة. ضع الأنابيب سعة 1.5 ملليلتر التي تحتوي على العينات والخرز على حامل فصل مغناطيسي لمدة خمس دقائق.
تخلص بعناية من المادة الطافية من العينات دون إزعاج الخرز. بعد تعليقها في 200 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 80٪ ، ضعها على حامل الفصل المغناطيسي لمدة ثلاث دقائق أخرى. بعد التخلص من الإيثانول الذي يحتوي على مادة طاف ، جفف العينات في الهواء في أنبوب لمدة 10 دقائق.
أعد تعليق الخرزات في 20 ميكرولترا من الماء الخالي من النيوكلياز واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. ثم ضعها على حامل الفصل المغناطيسي لمدة خمس دقائق. باستخدام ماصة ، انقل 18 ميكرولترا من المادة الطافية من كل أنبوب إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 1.5 ملليلتر.
أخيرا ، اتبع الخطوات الموضحة في النص لتوصيف ما قبل المكتبة ، متبوعا ببناء المكتبة وتنقيتها وقياسها. تم تطوير خطوط علامات Arabidopsis thaliana الفلورية عن طريق دمج البروتينات الفلورية مع الجينات المعبر عنها على وجه التحديد في أنواع الخلايا المستهدفة أو باستخدام خطوط مصيدة التحسين. تم فرز البروتوبلاستيدات الملحوظة الخاصة بالفلورة بنجاح بناء على شدة التألق ومفردات التشتت الأمامية والتشتت الجانبي.
تم تصور الخلايا التي تم فرزها باستخدام التصوير الساطع والتصوير الفلوري. النتائج التمثيلية لمكتبة تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA) لحوالي 2000 خلية محيطية من نسيج الخشب، وخلايا الجذر البدائي الجانبي، وخلايا الجلد الباطن أو القشرة، وخلايا غطاء الجذر الجانبي. لا يزال من الممكن تسلسل مكتبة صغيرة الحجم مع قمم dimer التمهيدي أو المحول بعد تحديد الحجم.
أشارت المكتبة ذات التوزيع غير الطبيعي للحجم إلى عدم نجاح إعداد المكتبة. تم تحليل أنماط التعبير الجيني. تم تجميع الجينات المخصبة في أي من أنواع الخلايا الجذرية الأربعة وتصويرها في خريطة حرارية توضح خصوصية التعبيرات الجينية بين أنواع الخلايا المختلفة.
تعد الجودة العالية والنقاء للخلايا المستهدفة من خلال البوابات والفرز الصحيحين ومنع تدهور الحمض النووي الريبي مفتاحا لنجاح بناء المكتبة. بالنسبة ل RNA-seq في وضع الخلية الواحدة ، تم الإبلاغ مؤخرا عن عدة طرق متكاملة مع المعرف الجزيئي الفريد مما أدى إلى تحسين الأداء بشكل كبير.
