يسجل هذا البروتوكول بنجاح تأثيرات الأكونيتين على IKv لخلايا H9C2. تعزيز مراحل جديدة للتحقيق في آلية السمية القلبية للأدوية من منظور القنوات الأيونية. تقنية المشبك التصحيح للخلية الكاملة هي المعيار الذهبي لأبحاث القناة الأيونية ذات الحساسية العالية والدقة العالية والنوعية العالية.
يمكن استخدام تقنية المشبك التصحيحي للخلية الكاملة لاستكشاف الآليات الدوائية أو السامة لبوابات القنوات الأيونية المحددة للأمراض متعددة الأنظمة ، مثل نظام القلب والأوعية الدموية والجهاز العصبي. للبدء ، اهضم الخلايا التي تحتوي على 0.25٪ تربسين لمدة 30 ثانية ، بمجرد أن يصبح طبق الاستزراع H9C2 متقاربا بنسبة 80٪. استزراع 2 مرات 10 إلى 5 خلايا لكل ملليلتر مع وسط عادي أو دواء يحتوي على وسط في طبق 35 ملم مغطى بالسجاد مع ألواح زجاجية لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية ، مع جو 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 70 إلى 80٪ رطوبة نسبية.
قم بتشغيل مجتذب micropipette وقم بالتسخين لمدة 30 دقيقة. ثم ضع شعرية زجاجية من البورسليكات مع خيوط على مجتذب الماصة الدقيقة. حدد البرنامج وانقر فوق Enter في لوحة التحكم.
انقر فوق برنامج المنحدر في الزاوية اليمنى العليا لتحديد القيمة الحرارية للشعيرات الدموية الزجاجية. اكتب البرنامج لسحب القطب وفقا للقيمة التي يحددها اختبار المنحدر وانقر على سحب لبدء تصنيع الماصات. قم بتشغيل المحول التناظري الرقمي ومضخم الإشارة والمعالج الدقيق والمجهر والكاميرا.
افتح تطبيق التصوير وبرنامج مضخم الإشارة وبرنامج الحصول على البيانات بالتسلسل. انقر فوق الحصول وحدد تحرير البروتوكول في برنامج الحصول على البيانات. قم بتحرير البرنامج في واجهة الموجة.
أدخل قيما للمستوى الأول ومستوى دلتا والمدة الأولى ومدة دلتا للعصر A والحقبة B والحقبة C.ثم انقر فوق واجهة معدل الوضع وقم بتعيين بيانات التسلسل الهرمي التجريبي. بعد ذلك ، انقر فوق تحرير البروتوكول لتحديد زر التحفيز وتعيين برنامج طرح التسرب في مربع حوار طرح تسرب PM. لإنشاء مسار تخزين البيانات ، انقر فوق ملف وحدد تعيين أسماء ملفات البيانات في برنامج الحصول على البيانات.
ثم افتح بروتوكول lKv الذي تم إنشاؤه عن طريق تحديد الحصول على البروتوكول المفتوح والنقر فوقه في برنامج الحصول على البيانات. أخيرا ، انقر فوق خيار الأدوات ، وحدد اختبار الغشاء لبدء تشغيل البروتوكول. أضف المحلول خارج الخلية إلى حمام الخلية على جهاز مشبك التصحيح للخلية الكاملة وضع الغطاء ينزلق لأعلى مع خلايا H9C2 في الحمام.
املأ 30٪ من الماصة بالمحلول خارج الخلية وقم بتثبيته على حامل قطب التسجيل المدمج في جهاز مشبك التصحيح. شد الماصة باستخدام حامل قطب التسجيل. ثم أسقط الماصة في الحمام باستخدام المناور الصغير.
انقر فوق واجهة إزاحة الماصة لبرنامج مضخم الإشارة للحفاظ على خط الأساس الحالي lKv عند صفر picoamps. قم بتوصيل ضغط إيجابي مناسب يدويا باستخدام حقنة سعة 1.0 ملليلتر ، متصلة بحامل قطب التسجيل ، من خلال أنبوب بلاستيكي. حرك الماصة قليلا عن طريق معالجة المناور الدقيق في ثلاثة أبعاد للاتصال بالخلية.
بمجرد أن يختبر الغشاء الموجة المربعة تنخفض بمقدار ثلث إلى نصف بعد أن تلمس الماصة غشاء الخلية ، قم بإزالة الضغط الإيجابي وتوصيل ضغط سلبي مناسب يدويا. ثم انقر فوق واجهة التصحيح لبرنامج الحصول على البيانات لتشكيل gigaseal. استخدم برنامج تعويض السعة السريع وتعويض السعة بطيئة الإشارة أثناء سقف الخلية للتعويض عن السعة السريعة والبطيئة.
ضع نبضات قصيرة من الضغط السلبي لتمزيق رقعة من غشاء الخلية. قم بتنفيذ تعويض سعة غشاء الخلية الكاملة بالنقر فوق زر الخلية الكاملة لبرنامج مضخم الإشارة. أخيرا ، احفظ البيانات وسجلها ، من خلال النقر على زر تسجيل البيانات.
افتح بيانات lKv المحفوظة باستخدام برنامج تحليل البيانات. احفظ علاقات الجهد الحالية. انقر فوق تحليل لتحديد الإحصائيات.
حدد النطاق ك Cursors 1 2 لتحليل البيانات ، وانقر فوق أزرار سعة الذروة والمتوسط ، ثم انقر فوق حسنا لعرض البيانات في صفحة النتائج. أخيرا ، انسخ عمود بيانات متوسط lKv في برنامج رسم الوظائف لمزيد من التحليل. احفظ آثار lKv الحالية التمثيلية.
انقر فوق تحرير لتحديد آثار النقل ، ثم حدد التتبع الكامل في المنطقة المراد نقلها. بعد ذلك ، انقر فوق تحديد في تحديد التتبع وحدد IN 0 في الإشارات. أخيرا ، انقر فوق "موافق" لعرض البيانات في صفحة النتائج ونسخ إجمالي البيانات إلى برنامج رسم الوظائف لرسم الآثار الحالية.
احفظ بروتوكول lKv. انقر فوق تحرير لتحديد إنشاء إشارة شكل موجة التحفيز وحدد موافق. ثم كرر الخطوة لرسم آثار التيار دون تحديد الإشارة.
تم تشغيل lKv بواسطة 150 مللي ثانية من تحفيز النبض غير المستقطب من ناقص 40 إلى زائد 60 مللي فولت عند الاحتفاظ بجهد ناقص 60 مللي فولت. ظهر lKv من خلايا عضلة القلب H9C2 الفئران لأول مرة حول ناقص 20 مللي فولت ، ثم زادت السعة مع مزيد من إزالة الاستقطاب. بالمقارنة مع المجموعة الضابطة ، تم تقليل سعة lKv بشكل ملحوظ بعد خمس دقائق من العلاج مع 1.5 مليمولار 4-AP.
بالإضافة إلى ذلك ، انخفض الجهد الكلي بشكل ملحوظ عند إمكانات الغشاء من 10 إلى 60 مللي فولت بطريقة تعتمد على الجرعة ، بعد العلاج بالتيار المتردد لمدة 24 ساعة. يمكن استخدام الخلية الفردية بعد تسجيل القناة الأيونية لمزيد من تقييم أوميكس الخلية الواحدة ، مثل علم الجينوم أحادي الخلية ، وعلم النسخ ، والبروتينات ، والأيض.
