يشكر المؤلفون نادين ويتاسكي وبيتر فولك للمساعدة التقنية. بالإضافة إلى ذلك، يشكر المؤلفون السيدة كلوديا لورينز (الكاتب الطبية، أكسيديس) لمساعدتها في إعداد المخطوطة. هذه المخطوطة كانت تدعمها ماليا DFG (شلو 324/7-1).

ويجري التحقيق وفقا لدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية التي نشرتها "لنا المعهد الوطني للصحة" (المعاهد الوطنية للصحة المنشور رقم 85-23، تنقيح عام 1996). وبصفة عامة، ويستار الذكور الذين تتراوح أعمارهم بين 3 إلى 4 أشهر، ومع متوسط وزن 250-350 جرام وتستخدم لهذا البروتوكول. قلب فأر واحد غير كافية من أجل 20 ثقافة الأطباق (1 مل كل طبق؛ والقطر الداخلي: 35 ملم) مع بكثافة خلية تقريبي 1.5 × 10 4 خلايا/1000 مم 2-
 1. إعداد الوسائط والمواد الكاشفة <ol><li>الكرياتين-كارنيتيني-توراين المتوسطة (المتوسطة CCT) ملاحظة: CCT المتوسطة وسيلة معقدة تستند إلى المتوسطة 199 بالإضافة إلى الكرياتين والكارنيتين وتوراين.
	<ol><li>ل 1 إعداد متوسطة 199: إضافة 3.6 غ حبيس ومزيج ح 1. ثم قم بإضافة ملغ 655.5 الكرياتين (5 ملم)، 395.4 ملغ كارنيتيني (2 مم) و 625.5 ملغ توراين (5 مم). كارنيتيني وتوراين تغيير درجة الحموضة إلى &#60; 7. كي تمنع نمو أي تلويث الخلايا، مثل خلايا بطانية أو الليفية، إضافة 10 ميكرون السيتوزين β-د-أرابينوفورانوسيدي إلى المتوسط. ضبط درجة الحموضة مع هيدروكسيد الصوديوم (2 مم) إلى تصفية 7.4 وعقيمة المتوسط. تخزين متوسطة CCT في 4 ° C.</li>
	</ol></li> <li>المتوسطة بأول <ol><li>لأول ل متوسطة الحجم، تذوب ز 6.43 كلوريد الصوديوم (110 مم) مع ز 0.19 بوكل (2.5 مم)، 0.16 ز خ 2 ص 4 (1.2 مم)، 0.3 ز مجسو 4 7 ح 2 س (1.2 مم)، ز 5.96 حبيس (25 مم)، و 1.98 غ د (+ )-مونوهيدرات (10 ملم) من الجلوكوز في أكوا العقيمة. ضبط الأس الهيدروجيني مع هيدروكسيد الصوديوم (2 م) لتصفية 7.4 وعقيمة المتوسط. المتوسطة بأول متجر في 4 ° C.</li>
	</ol></li> <li>كلوريد الكالسيوم (كاكل 2) <ol><li>إعداد حل 100 مم كاكل 2 (50 مل) وإعداد مختبرين تحتوي على 500 ميليلتر كاكل 2. تجميد مختبرين في-20 درجة مئوية.</li>
	</ol></li> <li>إعداد متوسطة الثقافة <ol><li>تحضير ثلاث وسائل الثقافة الخلية: قبل التصفيحات المتوسطة والمتوسطة والطلاء والمتوسطة الغسيل. استخدام CCT المتوسطة كالأساس لجميع وسائل الإعلام الثلاثة (الجدول 1). حساب CCT المتوسطة مع 1 مل كل طبق الثقافة. لذلك، إعداد 20 مل CCT المتوسطة 20 ثقافة الأطباق (القطر الداخلي: 35 ملم)-</li>
		<li>خلية ثقافة لوحات: معطف كل لوحة الثقافة الخلية (القطر الداخلي: 35 ملم) مع 1 مل قبل التصفيحات المتوسطة. تخزين لوحات المغلفة عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها، أو على الأقل 2 ح قبل استخدام.</li>
	</ol></li></ol> 2. عزل Cardiomyocytes الكبار <ol><li>نظام التروية "إعداد لانجيندورف" <ol><li>الحرارة المتوسطة والطلاء والمتوسطة الغسيل إلى 37 درجة مئوية. رفع التجميد عن أنبوب 500 ميليلتر كاكل 2 وتزن 25 ملغ كولاجيناز.</li>
		<li>طرد نظام التروية لانجيندورف مع أكوا العقيمة، بعد ذلك اسمحوا المتوسطة بأول تعميم نظام الحد الأدنى 5</li>
		<li>تعبئة نظام التروية لانجيندورف مع 80 مل المتوسطة بأول دون أي الهواء فقاعات والغاز المتوسطة مع الأكسجين 95%.</li>
		<li>إعداد أنبوب (50 مل) مع 40 مل بأول متوسط والحرارة عليه إلى 37 درجة مئوية، والغاز أنه مع الأكسجين 95%.</li>
		<li>إعداد مؤشر ترابط حوالي 25 سم في الطول لربط قلب إزالتها إلى القنية.</li>
		<li>ديجريسى شفرة حلاقة مع الكحول (70 في المائة من حيث الحجم)، وربط ذلك بالمروحية. المشبك قرص بلاستيك إلى المروحية.</li>
	</ol></li> <li>استخراج القلب <ol><li>تخدير ذكور جرذان ويستار مع isoflurane 4% إلى 5% والتضحية به مع التفكك عنق الرحم. فتح البطن خلف قوس الساحلي مع قص البطن، ومع نفس زوج من مقص، قطع طريق الحاجز لفتح تجويف الصدر.</li>
		إزالة <li>القلب، جنبا إلى جنب مع الرئة والغدة الصعترية، بالقطع أعلاه الغدة الصعترية الجمجمة عاليا في تجويف الصدر. نقل هذه المواد إلى المحلول الملحي المثلج فورا.</li>
		<li>إزالة الرئة والغدة الصعترية من القلب مع مقص تشريح (كبير) والتي فيكساتينج المواد مع الملقط كبسولة، نقل الأخير إلى حل مالحة جديد.</li>
	</ol></li> <li>عزلة <ol><li>إزالة الأنسجة الزائدة، مثل مخلفات الغدة الصعترية، القصبة الهوائية، والدهون والنسيج الضام من القلب باستخدام الملقط الكبسولة ومقص تشريح (كبيرة أو صغيرة). كشف الشريان الاورطي وقطع عليه مع مقص تشريح (كبيرة أو صغيرة) بين المهندس الأول والثاني التطور</li>
		<li>بدء نازف نظام التروية لانجيندورف. مكان القلب في قنية نظام التروية لانجيندورف ويحملق أولاً مع المشبك التماسيح ولاحقا مع الصفحات المعدة. شطف القلب حتى أنها خالية من الدم.</li>
		<li>حل 25 ملغ كولاجيناز في 5-6 مل المتوسطة بأول الحارة وإضافة 12.5 ميليلتر كاكل 2 (30 ميكرومتر).</li>
		إغلاق الدورة الدموية عن طريق تحريك قمع زجاج، الذي يرتبط بنظام التروية لانجيندورف، عبر قلب نازف <li>وإضافة كولاجيناز حل لنظام التروية. تبدأ نضح لمدة 25 دقيقة سرعة قطره قطره 1 في الثانية الواحدة. 
		ملاحظة: أثناء التروية، القلب سوف تضخم والحصول على مظهر شمعي.</li>
		<li>توقف التروية بعد 25 دقيقة وإزالة القلب من نظام التروية لانجيندورف. إزالة الشريان الاورطي، الاذينين، والنسيج الضام من القلب وفتح البطينين الأيمن والأيسر.</li>
		<li>يقطع القلب مرتين بزاوية مقدارها 90 درجة (خفض العرض: 0.7 مم؛ والسرعة: 0.15 سم/ثانية). كرر هذه العملية يدوياً مع المشارط هما 10 s كل جانب.</li>
		<li>نقل 12 مل الوسط التروية في أنبوب جديد (50 مل). صب ملاط الخلية في هذه الخلايا المتوسطة وملخص لآخر خمس دقائق في 37 درجة جيم ميكس الحل كل دقيقة-</li>
		<li>تصفية الحل مع قلب هضمها من خلال شبكة نايلون (200 ميكرومتر) في أنبوب جديد (50 مل)-</li>
		<li>الطرد المركزي الحل الذي تم تصفيته في 29 س ز للحد الأدنى 3 تجاهل المادة طافية وإضافة 6 مل المتوسطة بأول الحارة بما في ذلك 12.5 ميليلتر كاكل 2 (250 ميكرومتر) إلى بيليه الخلية. ريسوسبيند بيليه من خلال حركات الهز السلس. الطرد المركزي مرة أخرى في 29 س ز 2 دقيقة تجاهل المادة طافية وإضافة 6 مل الحارة المتوسطة بأول محل 25 ميليلتر كاكل 2 (500 ميكرومتر). حل بيليه الخلية من خلال حركات الهز لطيف وإضافة 12 مل الحارة بأول المتوسط بما في ذلك 120 ميليلتر كاكل 2 (1 مم). أجهزة الطرد المركزي لمرة ثالثة في 16 x ز لمدة 1 دقيقة. ومرة أخرى، إزالة المادة طافية.</li>
		<li>ميكس بيليه الخلية مع متوسط حرارة قبل الطلاء.</li>
		<li>إزالة الطلاء قبل المتوسطة من لوحات الثقافة. نقل 1 مل تصفيح المتوسطة، بما في ذلك كارديوميوسيتيس معزولة، لكل لوحة الثقافة. احتضان الطازجة cardiomyocytes معزولة في 37 درجة مئوية حاء 1</li>
		إزالة <li>المتوسطة الطلاء من لوحات الثقافة. أضف 1 مل غسل المتوسطة لكل لوحة الثقافة وتخزين لوحات عند 37 درجة مئوية إلى ستة أيام دون تغيير في المتوسط-</li>
		<li>للتحقيق في تأثير المواد الكيميائية المختلفة والعلاجات في أرفك، أولاً تحديث المتوسطة والطلاء بغسل المتوسطة وبعد ذلك إضافة مواد كيميائية مختلفة- 
		ملاحظة: التقييم بالفحص المجهري الخفيفة: مع كل إعداد الخلية، ينبغي رصد cardiomyocytes 150 إلى 300 يوميا بالفحص المجهري الخفيفة. تقسيم cardiomyocytes جميع الأصوات التي تم فرزها في مجموعات حسب مظهرها (مثلاً، &#34; على شكل قضبان &#34;، &#34; جولة أسفل &#34;، &#34; نشر &#34;، و &#34; مظهر غير عادي &#34;). الفئة &#34; نشر &#34; يشمل جميع كارديوميوسيتيس مع هياكل مثل بسيودوبوديا. &#34; مظهر غير عادي &#34; ويشمل جميع أرفك مع سطح غير نظامية وغشاء الخلية لا يمكن كشفها سليمة.</li>
	</ol></li></ol> 3. مثال تجارب <ol><li>Fluorescence/الفلورة تلوين للكبار كارديوميوسيتيس <ol><li>تحليل التحويلات البنيوية والهيكلية من أرفك أثناء زراعة بالليزر [كنفوكل] مجهرية. استخدام فالويدين-تريتك للتحقيق فيها الهياكل واكتين في &#34; على شكل قضبان &#34;، &#34; جولة أسفل &#34;، و &#34; نشر &#34; أرفك. القيام بتلوين وفقا للشركة المصنعة &#39; بروتوكول s. ويرد مثال لتلطيخ فالويدين-تريتك في إشارة نبيرت et al. 11-مع تلطيخ الأسفار/الفلورة، الاختلافات في دي-وإعادة-differentiation جهاز الهوس في cardiomyocytes الكبار المزروعة بين العلاجات التجريبية (مثلاً، مع Swiprosin-1، إيونوميسين) يمكن أن يحقق.</li>
	</ol></li> <li>(قرة-PCR) الكمية في الوقت الحقيقي RT-PCR <ol><li>أداء بكر قرة للتحقيق في التغيرات في التعبير مرناً من جينات مختلفة (مثل OSM، سويبروسين-1، β-MHC) أثناء زراعة أرفك. لحجم عينة كاف، استخدام أكبر ثقافة الأطباق (القطر الداخلي: 60 ملم) بحجم 2 مل. أرفك من خمسة ثقافة الأطباق غلة عينة واحدة. إجراء عزل مرناً والتحول من كدنا وفقا للشركة المصنعة &#39; بروتوكول s-</li>
	</ol></li> <li>تقنيات إيمونوبلوت <ol><li>"أداء اسطوانات الغربية يقوم" التحقيق في تغيرات في التعبير البروتين (مثلاً، سويبروسين-1) أثناء زراعة أرفك. استخدام الثقافة صحن واحد (1 مل) كل عينة.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Schl&#252;ter, K. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cardiomyocytes - Active Players in Cardiac Disease. , (2016).</li><li>Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+of+calcium+stable+adult+cardiac+myocytes.">Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).</li><li>Schl&#252;ter, K. -. D., Schreiber, D., Fabbro, D., McCormick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+ventricular+cardiomyocytes:+isolation+and+culture.">Adult ventricular cardiomyocytes: isolation and culture.</a> Protein Tyrosine Kinases: From Inhibitors to Useful Drugs. 290, 305-314 (2005).</li><li>Eppenberger, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemical+analysis+of+the+regeneration+of+myofibrils+in+long-term+cultures+of+adult+cardiomyocytes+of+the+rat.">Immunocytochemical analysis of the regeneration of myofibrils in long-term cultures of adult cardiomyocytes of the rat.</a> Dev. Biol. 130 (1), 1-15 (1988).</li><li>Burrows, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cultivation+of+tissues+of+the+chick-embryo+outside+the+body.">The cultivation of tissues of the chick-embryo outside the body.</a> JAMA. 55 (24), 2057-2058 (1910).</li><li>Cavanaugh, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsation,+migration+and+division+in+dissociated+chick+embryo+heart+cells+in+vitro.">Pulsation, migration and division in dissociated chick embryo heart cells in vitro.</a> J Exp Zool A Eco Genet Physiol. 128 (3), 573-589 (1955).</li><li>Muir, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+observation+on+the+cellular+structure+of+cardiac+muscle.">Further observation on the cellular structure of cardiac muscle.</a> J. Anat. 99, 27-46 (1965).</li><li>Powell, T., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+technique+for+the+isolation+and+purification+of+adult+cardiac+muscle+cells+having+respiratory+control+and+a+tolerance+to+calcium.">A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium.</a> Biochem. Biophys. Res. Com. 72 (1), 327-333 (1976).</li><li>Schwarzfeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+development+in+cell+culture+of+myocardial+cells+of+the+adult+rat.">Isolation and development in cell culture of myocardial cells of the adult rat.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 13 (6), 563-575 (1981).</li><li>Kubin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncostatin+M+is+a+major+mediator+of+cardiomyocyte+dedifferentiation+and+remodeling.">Oncostatin M is a major mediator of cardiomyocyte dedifferentiation and remodeling.</a> Cell Stem Cell. 9 (5), 420-432 (2011).</li><li>Nippert, F., Schreckenberg, R., Hess, A., Weber, M., Schl&#252;ter, K. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+Swiprosin-1+on+the+formation+of+pseudopodia-like+structures+and+&#946;-adrenoceptor+coupling+in+cultured+adult+rat+ventricular+cardiomyocytes.">The effects of Swiprosin-1 on the formation of pseudopodia-like structures and &#946;-adrenoceptor coupling in cultured adult rat ventricular cardiomyocytes.</a> PLoS ONE. 11 (12), e0167655 (2016).</li><li>Moses, R. L., Claycomb, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorganization+and+reestablishment+of+cardiac+muscle+cell+ultrastructure+in+cultured+adult+rat+ventricular+muscle+cells.">Disorganization and reestablishment of cardiac muscle cell ultrastructure in cultured adult rat ventricular muscle cells.</a> J. Ultrastruct. Res. 81 (3), 358-374 (1982).</li><li>Eppenberger-Eberhardt, M., Flamme, I., Kurer, V., Eppenberger, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reexpression+of+&#945;-smooth+muscle+actin+isoform+in+cultured+adult+rat+cardiomyocytes.">Reexpression of &#945;-smooth muscle actin isoform in cultured adult rat cardiomyocytes.</a> Dev. Biol. 139 (2), 269-278 (1990).</li><li>Fedak, P. W., Verma, S., Weisel, R. D., Skrtic, M., Li, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+remodeling+and+failure:+from+molecules+to+man+(Part+III).">Cardiac remodeling and failure: from molecules to man (Part III).</a> Cardiovasc. Pathol. 14 (3), 109-119 (2005).</li><li>Leri, A., Kajstura, J., Anversa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+myocardial+regeneration.">Mechanisms of myocardial regeneration.</a> Trends Cardiovasc. Med. 21 (2), 52-58 (2011).</li><li>Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+remodeling-concepts+and+clinical+implications:+A+consensus+paper+from+an+international+forum+on+cardiac+remodeling.">Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an international forum on cardiac remodeling.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 35 (3), 569-582 (2000).</li><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular biology of the cell. , (2015).</li><li>P&#246;ling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Janus+face+of+OSM-mediated+cardiomyocyte+dedifferentiation+during+cardiac+repair+and+disease.">The Janus face of OSM-mediated cardiomyocyte dedifferentiation during cardiac repair and disease.</a> Cell Cycle. 11 (3), 439-445 (2014).</li><li>Decker, M. L., Behnke-Barclay, M., Cook, M. G., Lesch, M., Decker, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+evaluation+of+the+contractile+apparatus+in+primary+cultures+of+rabbit+cardiac+myocytes.">Morphometric evaluation of the contractile apparatus in primary cultures of rabbit cardiac myocytes.</a> Circ. Res. 69 (1), 86-94 (1991).</li></ol>

أظهرت النتائج جزء من رسالة الدكتوراه من [فرنزيسكا نيبيرت.

يتأثر سلوك cardiomyocytes الكبار في فيفو بكثير من التفاعلات مع خلايا أخرى (مثلاً، الخلايا العصبية، خلايا بطانية، والخلايا الليفية، الخلايا الملتهبة) وسينسيتيوم الكهربائية التي تشكل1. ولذلك يتطلب دراسة التكيف مع الإجهاد من كارديوميوسيتيس الكبار حصرا بالعزلة وزراعة أرفك. ?...

كارديوميوسيتيس الكبار في فيفو العمل سينسيتيوم كهربائية استناداً إلى خلية خلية الاتصالات بين ميوسيتيس. وباﻹضافة إلى ذلك، فهي تتأثر بالخلايا المجاورة مثل القلب الليفية والخلايا البطانية والخلايا العصبية والخلايا الملتهبة1. من أجل دراسة قدرة كارديوميوسيتيس على التكيف مع تلك المنظمة داخل الخلايا لتغيير ظروف الحمل، كما رأينا خلال تضخم القلب، الذي هو خطوة أولية مما يؤدي إلى قصور القلب، والعزلة وزراعة الفئران البطين الكبار كارديوميوسيتيس (أرفك) هو اللازمة2،،من34. تاريخيا، كانت أولاً cardiomyocytes معزولة من الفرخ الجنينية قلوب5،6. بضع سنوات في وقت لاحق، وصفت الأولى عزل cardiomyocytes الميؤوس من شفائهم المتباينة باستخدام الكالسيوم استنفاد7. بيد أن هذه كارديوميوسيتيس الكبار لم تكن الكالسيوم متسامح ولذلك لا يمكن استخدامها لفحوصات فنية. وأخيراً، تمكين بروتوكول جديد في عام 1976 بأول وتطور التحقيق في cardiomyocytes البطين الكبار تحت الظروف الفسيولوجية8. وكخطوة أولى، أنها معزولة cardiomyocytes الكبار تحت تركيزات منخفضة من الكالسيوم والكالسيوم بعد ذلك زيادة التركيزات الفسيولوجية في إجراء التدرجي. اليوم، معظم البروتوكولات لعزل وزراعة كارديوميوسيتيس الكبار يعمل بهذا البروتوكول الكالسيوم واستخدام كولاجيناز الهضم الأنزيمي من اتصالات كثيفة خلية-خلية1.
زراعة ناجحة، مطلوب مصل العجل الجنين (FCS) أو oncostatin م (OSM). أرفك أداء دي-وإعادة-differentiation مع تغييرات هيكلية واسعة النطاق بما في ذلك ساركومير التفكيك واصلاحهم9،10،،من1112. هذه العملية هو مصحوبا بتعبير إعادة جينات نوع الجنين، مثل سلسلة ثقيلة β-الميوسين (β-MHC)، كما يعرف من تضخم، وتشكيل هياكل مثل بسيودوبوديا، وتسمى أيضا نشر4،11، 13-وعلاوة على ذلك، سويبروسين-1 (EFHD2)، بروتين محددة حديثا، دوراً رئيسيا عملية التفريق بين إعادة زراعتها أرفك11. نتيجة لذلك أرفك في ثقافة تحويل الخلايا على نطاق واسع، والأشكال التي تظهر تقلصات تلقائية بعد أسبوعين أو ثلاثة أسابيع في الثقافة2،،من414.
الاكتشافات الأخيرة قد كشفت عن أن القلب re ودو differentiation كما يحدث في ظروف الثقافة يقلد الميزات ينظر في فيفو خلال القلب يعيد10،15. إعادة عرض القلب عملية رئيسية خلال أمراض القلب16. كما لا تزال أمراض القلب هي السبب الرئيسي للوفاة في المجتمعات الصناعية، من المهم فهم أفضل لبيولوجيا cardiomyocytes الكبار (الذين؛ عام 2015). عزل وزراعة أرفك يمكن أن تساعد على وضع استراتيجيات جديدة وأدوية لعلاج أمراض القلب. ويرد مع هذه المخطوطة، بروتوكولا لعزل وزراعة أرفك. وعلاوة على ذلك، سلط الضوء على بعض الأجزاء الهامة من هذا الأسلوب في جزء المناقشة.

<table><tbody><tr><td>Langendorff perfusion system</td><td>inhouse construction</td><td></td><td>double-walled with a water&lt;br/&gt; based heating system</td></tr><tr><td>Tissue chopper Mc Ilwain</td><td>Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aortic Cannula, OD 1,8 mm</td><td>inhouse construction</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Abdominal shears</td><td>Aeskulap</td><td>BC772R</td><td></td></tr><tr><td>Capsule forceps</td><td>Eickemeyer</td><td>171307</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting scissor large</td><td>Aeskulap</td><td>BC562R</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting scissor small</td><td>Aeskulap</td><td>BC163R</td><td></td></tr><tr><td>Mash with Polyamid</td><td>Neolab</td><td>4-1413</td><td>mash size 200 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>plastic disc</td><td>Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Typ II</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and cultivation of adult rat cardiomyocytes

في قلب سليمة، وتأثير الخلايا المجاورة cardiomyocytes الكبار. مع طريقة العزل وزراعة كارديوميوسيتيس الكبار، إجراء تحقيق دقيق لسلوك هذه الخلايا ضمن بيئات وعلاجات محددة أمر ممكن. ويعرض هذه المخطوطة بروتوكول لعزل ناجحة وزراعة cardiomyocytes البطين الفئران الكبار (أرفك).
هو التضحية بالفئران بخلع عنق الرحم تحت التخدير العميق. ثم، يتم استخراج القلب والشريان الاورطي كشف. وفي وقت لاحق، يتم نضح على نظام التروية لانجيندورف مع نضوب الكالسيوم والعلاج كولاجيناز. بعد ذلك، أنسجة البطين يحصل مفروم، إعادة توزيع، وتصفيتها، تليها ثلاث خطوات استخدام الطرد المركزي مع الإضافة التدريجية كاكل2 حتى يتم التوصل إلى تركيز الكالسيوم الفسيولوجية. يتم مطلي أرفك في خلية ثقافة الأطباق. بعد تحديث مستنبت الخلية، أرفك يمكن أن تزرع لمدة تصل إلى ستة أيام دون تغيير وسيلة الثقافة التي تحتوي على المصل. عزل أرفك عملية حساسة كالسيوم. التغييرات الصغيرة في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا يسبب نقصان في الجودة والسلامة للخلايا المعزولة.
أرفك على شكل قضيب طازجة معزولة. في الأيام الأولى للزراعة فإنها تفقد على شكل قضيب مورفولوجيا ونموذج pseudopodia مثل هياكل (نشر). خلال هذا التكوين المورفولوجي أرفك في البداية تتحلل عناصرها الهوس متبوعاً إصلاح عن طريق ألياف الأكتين الإجهاد و حيثياته ساركوميروجينيسيس. بعد أسبوع واحد من زراعة، تظهر معظم أرفك مظهر على نطاق واسع مع سترييشن عبر وضوح قابلة للاكتشاف. هذه العملية حساسة لتركيز الكالسيوم داخل الخلايا، كما يخفف العلاج مع إيونوميسين نشر. هي علامات رئيسية في هذه العملية دي وإعادة ديفيرينتييشن β-الميوسين سلسلة ثقيلة (β-MHC) و oncostatin م (OSM) سويبروسين-1 (EFHD2). وأشارت الدراسات الأخيرة أن القلب re ودو ديفيرينتييشن التي تحدث في ظروف الثقافة يحاكي ميزات ينظر في فيفو أثناء إعادة عرض القلب. ولذلك، عزل وزراعة أرفك تلعب دوراً أساسيا في فهم بيولوجيا كارديوميوسيتيس.

Cardiomyocytes الكبار في الثقافة: ويبين الشكل 1 نظرة عامة cardiomyocytes الكبار طازجة معزولة ح 2 بعد الغسيل الأخير. وكان حوالي 75% من جميع كارديوميوسيتيس التشكل على شكل قضيب. وأظهرت نسبة 25 في المائة المتبقية مظهر غير عادية مع مورفولوجيا جولة وغشاء الخلية لا يمكن ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes at JoVE.com

Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

نقدم هنا، على بروتوكول لعزل وزراعة cardiomyocytes البطين الفئران الكبار (أرفك). يمكن استخدام أرفك معزولة لزراعة قصيرة وطويلة الأجل. عزل وزراعة أرفك يمكن أن تلعب دوراً رئيسيا في تطوير نظم المعالجة الجديدة لأمراض القلب.

عزل وزراعة كارديوميوسيتيس الفئران الكبار

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise ...

isolation-and-cultivation-of-adult-rat-cardiomyocytes

Research

JoVE Journal

Medicine

15.5K Views.  Justus Liebig University Giessen. نقدم هنا، على بروتوكول لعزل وزراعة cardiomyocytes البطين الفئران الكبار (أرفك). يمكن استخدام أرفك معزولة لزراعة قصيرة وطويلة الأجل. عزل وزراعة أرفك يمكن أن تلعب دوراً رئيسيا في تطوير نظم المعالجة الجديدة لأمراض القلب.

Video: Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

Isolation and Cryopreservation of Neonatal Rat Cardiomyocytes

Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is difficult and time consuming. The most commonly used cells are neonatal rat cardiomyocytes (NRCMs), which require isolation every time cells are needed. The birth of the rats can be unpredictable. Cryopreservation is proposed to allow for cells to be stored until needed, yet freezing/thawing methods for primary cardiomyocytes are challenging due to the sensitivity of the cells. Using the proper cryoprotectant, dimethyl sulfoxide (DMSO), cryopreservation was achieved. By slowly extracting the DMSO while thawing the cells, cultures were obtained with viable NRCMs. NRCM phenotype was verified using immunocytochemistry staining for &#945;-sarcomeric actinin. In addition, cells also showed spontaneous contraction after several days in culture. Cell viability after thawing was acceptable at 40-60%. In spite of this, the methods outlined allow one to easily cryopreserve and thaw NRCMs. This gives researchers a greater amount of flexibility in planning experiments as well as reducing the use of animals.

The isolation of neonatal rat cardiomyocytes is a time consuming and unpredictable procedure. This study describes methods for cryopreservation and thawing of neonatal rat cardiomyocytes that allows for more efficient use of cells. The thawed NRCMs can be used for various experiments without the need for performing isolations each time.

العزلة والحفظ بالتبريد من الأطفال حديثي الولادة الجرذ العضلية

Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is ...

Developmental Biology

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

الابتدائية ثقافة الكبار Myocytes قلب فأر

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Biology

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and a working heart on the other. Thus, cardiomyocytes serve as good models for cardiac cellular physiology and pathophysiology, for pharmaceutical investigations as well as for the exploration of transgenic animal models. Here we describe a method of isolating the cells from the heart. Furthermore we show how a genetic manipulation on cardiac myocytes can be performed without breeding a transgenic animal: This is the combination of long term culture (1 week) and adenoviral gene transfer. The latter one is described from the construction of the virus to the transduction of the cells. It can be used for the expression of genetically encoded biosensors (GEBs), fluorescent fusion proteins, but also for protein over expression and down regulation, e.g. using RNAi. Here we provide an example for the expression of a fusion protein staining a subcellular structure (Golgi). Such protein expression can be visualized by confocal imaging of z-stacks for a 3D-reconstruction of subcellular structures. The protocol comprises state-of-the-art in cell culture, molecular biology and biophysics and thus provides an approach for exploring new horizons in cellular cardiology.

Adult cardiac myocytes are primary cells that can be isolated from animal hearts and cultured for several days. Within this culture period adenoviral gene transfer can be used to express genetically encoded biosensors (GEBs) or fluorescent fusion proteins. Both approaches allow cellular investigations by means of confocal microscopy.

العزلة والتلاعب الجيني لأمراض القلب للبالغين Myocytes التصوير متحد البؤر

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

العزلة وثقافة الأطفال حديثي الولادة ماوس العضلية

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

العزلة والثقافة، وتوصيف وظيفي من الكبار ماوس Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation of Atrial Cardiomyocytes from a Rat Model of Metabolic Syndrome-related Heart Failure with Preserved Ejection Fraction

In this article, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes (ACMs) from a rat model of metabolic syndrome (MetS)-related heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF). The prevalence of MetS-related HFpEF is rising, and atrial cardiomyopathies associated with atrial remodeling and atrial fibrillation are clinically highly relevant as atrial remodeling is an independent predictor of mortality. Studies with isolated single-cell cardiomyocytes are frequently used to corroborate and complement in vivo findings. Circulatory vessel rarefication and interstitial tissue fibrosis pose a potentially limiting factor for the successful single-cell isolation of ACMs from animal models of this disease.
We have addressed this issue by employing a device capable of manually regulating the intraluminal pressure of cardiac cavities during the isolation procedure, substantially increasing the yield of morphologically and functionally intact ACMs. The acquired cells can be used in a variety of different experiments, such as cell culture and functional Calcium imaging (i.e., excitation-contraction-coupling).
We provide the researcher with a step-by-step protocol, a list of optimized solutions, thorough instructions to prepare the necessary equipment, and a comprehensive troubleshooting guide. While the initial implementation of the procedure might be rather difficult, a successful adaptation will allow the reader to perform state-of-the-art ACM isolations in a rat model of MetS-related HFpEF for a broad spectrum of experiments.

Here, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes from a rat model of metabolic syndrome-related heart failure with preserved ejection fraction. A manual regulation of intraluminal pressure of cardiac cavities is implemented to yield functionally intact myocytes suitable for excitation-contraction-coupling studies.

عزل كارديوميوسيتيس خوارج من نموذج الفئران من فشل القلب المتصلة بالمتلازمة الأيضية مع كسر قذفي الحفاظ على

In this article, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes (ACMs) from a rat model of ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult cardiomyocytes are widely accepted as a good model for cardiac cellular physiology and pathophysiology, as well as for pharmaceutical intervention. Genetically modified mice preclude the need for complicated cardiomyocyte infection processes to generate the desired genotype, which are inefficient due to cardiomyocytes&#8217; terminal differentiation. Isolation and culture of high quantity and quality functional cardiomyocytes will dramatically benefit cardiovascular research and provide an important tool for cell signaling transduction research and drug development. Here, we describe a well-established method for isolation of adult mouse cardiomyocytes that can be implemented with little training. The mouse heart is excised and cannulated to an isolated heart system, then perfused with a calcium-free and high potassium buffer followed by type II collagenase digestion in Langendorff retrograde perfusion mode. This protocol yields a consistent result for the collection of functional adult mouse cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

We describe a reliable method for isolation of adult mouse cardiomyocytes. This protocol yields a consistent result for the culture of functional adult cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

العزلة وثقافة الكبار ماوس العضلية للاشارة الخليوي و<em&gt; في المختبر</em&gt; تضخم القلب

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

العزلة والثقافة وتنبيغ الخلايا العضلية ماوس الكبار

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and molecular functional experiments (e.g., contraction, electrophysiology, calcium cycling, etc.) on cardiomyocytes are the gold standard for establishing mechanism(s) of disease. The mouse is the species of choice for functional experiments and the described technique is specifically for the isolation of mouse cardiomyocytes. Previous methods requiring a Langendorff apparatus require high levels of training and precision for aortic cannulation, often resulting in ischemia. The field is shifting toward Langendorff-free isolation methods that are simple, are reproducible, and yield viable myocytes for physiological data acquisition and culture. These methods greatly diminish ischemia time compared to aortic cannulation and result in reliably obtained cardiomyocytes. Our adaptation to the Langendorff-free method includes an initial perfusion with ice-cold clearing solution, use of a stabilizing platform that ensures a steady needle during perfusion, and additional digestion steps to ensure reliably obtained cardiomyocytes for use in functional measurements and culture. This method is simple and quick to perform and requires little technical skill.

The gold standard in cardiology for cellular and molecular functional experiments are cardiomyocytes. This article describes adaptations to the non-Langendorff technique to isolate mouse cardiomyocytes.

طريقة بسيطة وفعالة لعزل خلايا عضلة القلب في الفئران باستمرار

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and ...

Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular mechanisms of cardiovascular disease progression such as cardiac hypertrophy, fibrosis, and atherosclerosis. Although several attempts with variable success have been made to develop immortalized cell lines from the cardiovascular system to understand these cellular mechanisms, primary cells offer a more natural and close to in vivo environment for such studies. Therefore, different laboratories working on a particular cell type have developed protocols to isolate individual types of rat cardiac cells of interest. A protocol that allows the isolation of more than one cell type, however, is missing. Here an optimized protocol is described that allows the isolation of high-quality major cardiac cell types (cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts) from a single preparation and enables their use for cellular analyses. This permits the most efficient use of available resources, which may save time and reduce research costs.

Several protocols have been developed and described for the isolation of different cardiac cell types from a rat heart. Here, an optimized protocol is described that allows the isolation of high-quality major cardiac cell types (cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts) from a single preparation, reducing the experimental costs.

العزلة في وقت واحد من كارديوميوسيتس عالية الجودة، الخلايا البطانية، والألياف الليفية من القلب الجرذ الكبار

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular ...