يمثل هذا البروتوكول مقايسة وظيفية في المختبر باستخدام الخلايا المتغصنة المشتقة من الخلايا الأحادية البقرية لقياس مناعة اللقاح قبل الدراسات في الجسم الحي. لذلك ، سد الفجوة الموجودة في تطعيم الماشية. إنه توليد وتطبيق الخلايا المتغصنة.
باعتبارها أقوى الخلايا المقدمة للمستضد ، أصبحت الخلايا المتغصنة هدفا بحثيا رئيسيا لفهم آليات المناعة داخل الخلايا بما في ذلك فعالية اللقاح. يمكن تنفيذ هذا الاختبار كأداة لفحص اللقاحات المرشحة ، كحالة لمراقبة الجودة لإنتاج اللقاح ، ولاختيار المستضد والمواد المساعدة. سيوضح الإجراء ريتشارد كانجيث ، العالم في مختبر الإنتاج الحيواني والصحة.
ابدأ بقلب وخلط الدم الذي تم الحصول عليه من ثقب الوريد الوداجي في ربلة الساق مع vacutainers الهيبارين. ثم نقل 20 ملليلتر من الدم الهيبارين إلى أنبوب معقم 50 ملليلتر وتخفيفه مع 10 ملليلتر من محلول ملحي مخزن الفوسفات أو برنامج تلفزيوني. ماصة 15 ملليلتر من الخلايا اللمفاوية عزل المتوسطة إلى أنبوب معقم 50 ملليلتر وإمالة الأنبوب إلى وضع 45 درجة.
ضع بعناية 30 ملليلترا من وسط PBS في الدم فوق عزل الخلايا الليمفاوية باستخدام ماصة 25 ملليلتر وأعد الأنبوب ببطء إلى وضع عمودي قبل الطرد المركزي. ثم اجمع الطبقة البيضاء الرقيقة من خلايا الدم أحادية النواة المحيطية أو طبقة PBMC باستخدام ماصة باستور وانقلها إلى أنبوب جديد سعة 50 ملليلتر. اغسل PBMCs المحصودة مرتين باستخدام 40 ملليلترا من PBS لكل غسلة واخلطها جيدا.
بعد الطرد المركزي ، أعد تعليق الحبيبات في 15 ملليلتر من محلول البوتاسيوم كلوريد الأمونيوم أو المخزن المؤقت ACK. بعد 10 إلى 15 دقيقة من الحضانة في درجة حرارة الغرفة ، أضف ما يصل إلى 40 ملليلتر من PBS وأجهزة الطرد المركزي للأنبوب بأقصى قدر من التسارع والتباطؤ. أعد تعليق الحبيبات في 10 ملليلتر من وسط الاستزراع الكامل.
ثم أضف خمسة ميكرولترات من المخزن المؤقت CD14 MicroBead لكل 10 ملايين خلية واخلطها جيدا باستخدام ماصة. لتحليل قياس التدفق الخلوي ، أضف 10 ميكرولتر من CD14 fluorescein isothiocyanate أو الجسم المضاد للتلطيخ FITC إلى PBMCs واحتضانه لمدة 15 دقيقة عند أربع إلى ثماني درجات مئوية قبل الشروع في قياس التدفق الخلوي. إلى PBMCs غير الملوثة ، أضف ملليلترا واحدا من المخزن المؤقت للفاكس وطرده لمدة سبع دقائق عند 500 جرام وأربع درجات مئوية.
ثم أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفاكس لكل 100 مليون خلية. بعد ذلك ، أدخل عمود فصل الخلايا المغناطيسية المناعية في الفاصل وضع أنبوب تجميع سعة 50 ملليلترا أسفل مخرج العمود لتجميع التدفق من خلاله. بعد غسل العمود بمخزن فاكس واحد ملليلتر منزوع الغاز ، استبدل الأنبوب المستخدم سعة 15 ملليلتر بآخر جديد.
ماصة مائة مليون خلية في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت في وقت واحد مما يسمح لتعليق الخلية بالمرور عبر العمود. ثم اشطف العمود ثلاث مرات بثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت للفاكس الذي تم تفريغه في كل مرة. بعد جمع التدفق ، قم بتسمية أول جزء من الخلايا الليمفاوية الساذجة المستخلصة على أنه جزء الخلية السالبة CD14.
قم بإزالة العمود من الفاصل وضع أنبوبا معقما جديدا سعة 15 ملليلتر أسفل العمود لجمع النفايات السائلة. أضف خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت للفاكس إلى العمود وادفعه على الفور باستخدام المكبس. اجمع وسمي التدفق الثاني أو جزء الخلية الوحيدة الساذج على أنه جزء الخلية الموجب CD14.
أضف وسط استزراع كامل إلى الخلايا الوحيدة الإيجابية CD14 المحصودة لتحقيق 1 مليون خلية لكل ملليلتر. بعد ذلك ، أضف معلقا واحدا من خلية ملليلتر إلى كل بئر من صفيحة معقمة من 24 بئرا قبل استكمال كل بئر ب 40 ميكرولترا من كوكتيل السيتوكين الموجود في المجموعة. في اليوم الثاني ، انقل نصف محتوى كل بئر إلى أنابيب فردية سعة 1.5 ملليلتر باستخدام ماصة.
بعد الطرد المركزي للأنابيب سعة 1.5 ملليلتر عند 500 جرام لمدة سبع دقائق ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من وسط الاستزراع الكامل الجديد. انقل 500 ميكرولتر من تعليق الخلية المعاد تعليقه مرة أخرى إلى الآبار المقابلة بحيث يصبح الحجم النهائي في البئر ملليلتر واحد. إثراء كل بئر مع 20 ميكرولتر من كوكتيل السيتوكين.
لتوليد MoDCs نبض المستضد ، أضف ميكرولتر واحد لكل ملليلتر من لقاح فيروس داء الكلب أو معلق RV إلى ملليلتر واحد من ثقافة MoDC الساذجة في لوحة 24 بئرا واحتضان اللوحة لمدة 48 ساعة عند 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 37 درجة مئوية. في اليوم السابع ، احتفظ باللوحة المكونة من 24 بئرا والتي تحتوي على MoDCs النبضية للمستضد على الجليد لمدة 10 دقائق قبل إضافة ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني بارد للثلج لكل بئر وخلطه جيدا. نقل التعليق إلى أنبوب 15 ملليلتر.
اغسل الآبار بمليلتر من الثلج البارد PBS. اجمع الخلايا المتبقية داخل كل بئر وانقل المحتويات المغسولة إلى الأنابيب الخاصة بها. أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية في 500G لمدة سبع دقائق.
بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق حبيبات خلايا MoDCs النبضية بالمستضد في وسط استزراع كامل لضبط التركيز النهائي البالغ 100،000 خلية لكل ملليلتر. بالنسبة للاستزراع المشترك للخلايا الليمفاوية MoDC ، قم بزرع آبار صفيحة معقمة من 24 بئرا مع ملليلتر واحد من معلق الخلايا الليمفاوية الساذجة وملليلتر واحد من معلق MoDC النبضي بالمستضد أو غير النبضي في اليوم السابع من نبضة المستضد. بعد يومين من الحضانة ، استكمل كل بئر ب 20 نانوجرام لكل مليلتر من الإنترلوكين -2 المؤتلف واستمر في الحضانة لمدة 120 ساعة أخرى.
في اليوم 14 ، انقل ملليلترا واحدا من الثقافة المشتركة إلى أنبوب معقم سعة 1.5 ملليلتر وطرد مركزي للأنبوب. ثم أعد تعليق حبيبات الخلية بمليلتر واحد من MoDCs النبضية أو غير النبضية. تخلط جيدا ونقل تعليق الخلية إلى الآبار المقابلة لها.
بعد تلطيخ سطح الخلية من PBMCs والخلايا الليمفاوية الساذجة والوحيدات ، انقل ملليلتر واحد من تعليق الخلية إلى أنبوب معقم سعة 1.5 ملليلتر باستخدام ماصة وأجهزة طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 500 جرام. ثم أعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من PBS وانقلها إلى أنبوب 15 ملليلتر. أيضا جمع الخلايا المتبقية والأنابيب المقابلة باستخدام ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني.
ثم أضف 10 ملليلتر من PBS إلى أنبوب 15 ملليلتر الذي يحتوي على الخلايا واخلطه عن طريق الماصة. بعد طرد الأنبوب لمدة سبع دقائق عند 850 جم ، قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية بعناية مع ترك التعليق المتبقي بعد صب المادة الطافية. انقل تعليق الخلية إلى لوحة 96 بئرا ذات قاع V وأغلق الآبار لتجنب الانسكاب.
بمجرد اكتمال التلوين ، قم بإجراء تحليل مقياس التدفق الخلوي. من المعاينة في الوقت الفعلي ، اضبط عتبة التألق بما في ذلك الجهد والكسب وحجم الخلية لرسم البوابات في النهاية حول مجموعة الخلايا المطلوبة مع استبعاد أي حطام خلوي. أظهر تلطيخ الخلايا CD14 وقياس التدفق الخلوي أن جزء الوحيدات الساذج يتألف من 98٪ من خلايا الخلايا الوحيدة الإيجابية CD14 وكان قادرا وظيفيا على امتصاص المستضد.
إن MoDCs الساذجة التي تتميز ظاهريا بتقييم تعبير MHC Class 2 وعلامات سطح الخلية CD86 و CD40 المحفزة المشتركة قد تحققت من صحة الخلايا المتغصنة أو النمط الظاهري الشبيه بالتيار المستمر. خلال المزرعة المشتركة للخلايا الليمفاوية MoDC في اليوم التاسع ، لوحظ تغير مورفولوجي يظهر امتداد التغصنات في نبضة RV إلى MoDCs. بالمقارنة مع ثقافة الخلايا الليمفاوية MoDC غير النبضية ، تم إظهار زيادة كبيرة في انتشار الخلايا الليمفاوية من خلال تنظيم علامات تنشيط Ki67 و CD25 على الخلايا التائية الإيجابية CD4 و CD8 الإيجابية في اليوم 16 في الثقافة المشتركة للخلايا الليمفاوية MoDC النبضية.
أظهرت الخلايا التائية الإيجابية CD8 من الثقافات المشتركة ل RV النبضية الناضجة MoDC تنظيما بمقدار ثمانية أضعاف ل Ki67 مقارنة بالمجموعة غير المحددة. أظهرت الخلايا الإيجابية CD4 في نفس الثقافة المشتركة زيادة بمقدار سبعة أضعاف في Ki67 مقارنة بالضوابط ، مما يدل على قدرة MoDCs المحضرة RV على تقديم مستضد RV إلى الخلايا الليمفاوية الساذجة وتنشيطها في حالة في المختبر. أظهر القياس الكمي qPCR للمزارع المشتركة زيادة بنسبة تزيد عن 30٪ في تعبير جاما الإنترفيرون وأكثر من 5٪ في تعبير Ki67 في جميع المزارع المشتركة باستخدام GAPDH كمعادل.
لوحظ تركيز أعلى بكثير من غاما الإنترفيرون المفرزة في الثقافة المشتركة للخلايا الليمفاوية MoDC النبضية RV مقارنة بمجموعة العلاج غير المحددة. قم بإجراء خطوة الطبقات ببطء شديد وبعناية ، مع التأكد من وضع الدم فوق وسط عزل الخلايا الليمفاوية. كن حذرا للغاية لجمع كل PBMCs دون جمع الكثير من المواد من الطبقات الأخرى.
يمكن تطبيق طرق أخرى مثل قياس التدفق الخلوي و ELISA و PCR الكمي ، من بين أمور أخرى ، بعد هذا الإجراء لتقييم تنشيط علامات المناعة.
