Questo protocollo rappresenta un saggio funzionale in vitro che utilizza cellule dendritiche derivate da monociti bovini per misurare l'immunogenicità del vaccino prima degli studi in vivo. Pertanto, colmando una lacuna esistente nella vaccinologia del bestiame. È la generazione e l'applicazione di cellule dendritiche.
Come le cellule presentanti l'antigene più potenti, le cellule dendritiche sono diventate un obiettivo di ricerca chiave per comprendere i meccanismi immunitari intracellulari, compresa l'efficacia del vaccino. Questo test può essere implementato come strumento per lo screening dei candidati vaccini, come stato di controllo della qualità per la produzione di vaccini e per la selezione dell'antigene e dell'adiuvante. A dimostrare la procedura sarà Richard Kangethe, scienziato del laboratorio di produzione e salute animale.
Inizia invertendo e mescolando il sangue ottenuto dalla puntura della vena giugulare del vitello con vacutainers eparinizzati. Quindi trasferire 20 millilitri di sangue eparinizzato in un tubo sterile da 50 millilitri e diluirlo con 10 millilitri di soluzione salina tamponata fosfato o PBS. Pipettare 15 millilitri di terreno di isolamento dei linfociti su un tubo sterile da 50 millilitri e inclinare il tubo in una posizione di 45 gradi.
Posizionare con cura 30 millilitri di terreno PBS di sangue sopra l'isolamento dei linfociti utilizzando una pipetta da 25 millilitri e riportare lentamente il tubo in posizione verticale prima di centrifugarlo. Quindi raccogliere il sottile strato bianco di cellule mononucleate del sangue periferico o strato di PBMC utilizzando una pipetta Pasteur e trasferirlo in un nuovo tubo da 50 millilitri. Lavare i PBMC raccolti due volte utilizzando 40 millilitri di PBS per lavaggio e mescolare accuratamente.
Dopo la centrifugazione, risospendere il pellet in 15 millilitri di tampone di potassio cloruro di ammonio o tampone ACK. Dopo 10-15 minuti di incubazione a temperatura ambiente, aggiungere fino a 40 millilitri di PBS e centrifugare il tubo con la massima accelerazione e decelerazione. Risospendere il pellet in 10 millilitri di terreno di coltura completo.
Quindi aggiungere cinque microlitri di tampone CD14 MicroBead per 10 milioni di cellule e mescolare accuratamente usando una pipetta. Per l'analisi della citometria a flusso, aggiungere 10 microlitri di isotiocianato di fluoresceina CD14 o anticorpo colorante FITC alle PBMC e incubarlo per 15 minuti a quattro-otto gradi Celsius prima di procedere con la citometria a flusso. Alle PBMC non macchiate, aggiungere un millilitro di tampone fax e centrifugarlo per sette minuti a 500 g e quattro gradi Celsius.
Quindi risospendere il pellet in 500 microlitri di tampone fax per 100 milioni di celle. Quindi, inserire la colonna di separazione cellulare immunomagnetica nel separatore e posizionare un tubo di raccolta da 50 millilitri sotto l'uscita della colonna per raccogliere il flusso attraverso. Dopo aver lavato la colonna con un buffer fax degassato da un millilitro, sostituire il tubo da 15 millilitri usato con uno nuovo.
Pipettare cento milioni di cellule in 500 microlitri di tampone alla volta consentendo alla sospensione cellulare di passare attraverso la colonna. Quindi sciacquare la colonna tre volte con tre millilitri di tampone fax degassato ogni volta. Dopo aver raccolto il flow-through, etichettare la prima frazione linfocitaria naïve eluita come frazione cellulare CD14 negativa.
Rimuovere la colonna dal separatore e posizionare un nuovo tubo sterile da 15 millilitri sotto la colonna per la raccolta degli effluenti. Aggiungere cinque millilitri di buffer fax nella colonna e spingerlo immediatamente attraverso utilizzando lo stantuffo. Raccogliere ed etichettare il secondo flusso attraverso o la frazione monocitaria naïve come frazione cellulare CD14 positiva.
Aggiungi terreno di coltura completo ai monociti CD14 positivi raccolti per ottenere 1 milione di cellule per millilitro. Quindi, aggiungere una sospensione cellulare da un millilitro a ciascun pozzetto di una piastra sterile a 24 pozzetti prima di integrare ciascun pozzetto con 40 microlitri del cocktail di citochine fornito nel kit. Il secondo giorno, trasferire metà del contenuto di ciascun pozzetto in singoli tubi da 1,5 millilitri utilizzando una pipetta.
Dopo aver centrifugato i tubi da 1,5 millilitri a 500 g per sette minuti, scartare il surnatante e risospendere il pellet in 500 microlitri di terreno di coltura fresco completo. Trasferire 500 microlitri di questa sospensione cellulare risospesa ai pozzetti corrispondenti in modo che il volume finale nel pozzo diventi di un millilitro. Arricchire ogni pozzetto con 20 microlitri di cocktail di citochine.
Per generare MoDC pulsate dall'antigene, aggiungere un microlitro per millilitro di vaccino contro il virus della rabbia o sospensione RV a un millilitro di coltura MoDC naïve nella piastra a 24 pozzetti e incubare la piastra per 48 ore al 5% di anidride carbonica e 37 gradi Celsius. Il settimo giorno, tenere la piastra a 24 pozzetti contenente i MoDC pulsati dall'antigene sul ghiaccio per 10 minuti prima di aggiungere un millilitro di PBS ghiacciato per pozzetto e mescolarlo accuratamente. Trasferire la sospensione su un tubo da 15 millilitri.
Lavare i pozzetti con due millilitri di PBS ghiacciato. Raccogliere le cellule residue all'interno di ciascun pozzetto e trasferire il contenuto lavato nei rispettivi tubi. Centrifugare la sospensione cellulare a 500g per sette minuti.
Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet cellulare MoDC pulsato dall'antigene in un terreno di coltura completo per regolare la concentrazione finale di 100.000 cellule per millilitro. Per la co-coltura di linfociti MoDC, seminare i pozzetti di una piastra sterile a 24 pozzetti con un millilitro di sospensione di cellule linfocitarie naïve e un millilitro di sospensione MoDC pulsata dall'antigene o non pulsata dall'antigene il settimo giorno dell'impulso dell'antigene. Dopo due giorni di incubazione, integrare ogni pozzetto con 20 nanogrammi per millilitro di interleuchina-2 ricombinante e continuare l'incubazione per altre 120 ore.
Il giorno 14, trasferire un millilitro di co-coltura in un tubo sterile da 1,5 millilitri e centrifugare il tubo. Quindi risospendere il pellet cellulare con un millilitro di MoDC pulsate dall'antigene o non pulsate. Mescolare bene e trasferire le sospensioni cellulari nei pozzetti corrispondenti.
Dopo la colorazione della superficie cellulare delle PBMC e dei linfociti e monociti naïve, trasferire un millilitro della sospensione cellulare in un tubo sterile da 1,5 millilitri usando una pipetta e centrifugare per 10 minuti a 500 g. Quindi risospendere il pellet in un millilitro di PBS e trasferirlo in un tubo da 15 millilitri. Raccogliere anche le celle residue e i tubi corrispondenti utilizzando un millilitro di PBS.
Quindi aggiungere 10 millilitri di PBS al tubo da 15 millilitri contenente le celle e mescolare mediante pipettaggio. Dopo aver centrifugato il tubo per sette minuti a 850g, rimuovere il surnatante e risospendere con attenzione il pellet cellulare con sospensione residua rimasta dopo la decantazione del surnatante. Trasferire la sospensione della cella su una piastra a V da 96 pozzetti e sigillare i pozzetti per evitare fuoriuscite.
Una volta completata la colorazione, eseguire l'analisi del citometro a flusso. Dall'anteprima in tempo reale, regolare la soglia di fluorescenza tra cui tensione e guadagno e dimensione della cella per disegnare eventualmente porte intorno alla popolazione cellulare desiderata escludendo eventuali detriti cellulari. La colorazione delle cellule CD14 e la citometria a flusso hanno mostrato che la frazione monocitaria naïve comprendeva il 98% di cellule monocitarie CD14 positive ed era funzionalmente in grado di assorbire l'antigene.
Le MoDC naïve fenotipicamente caratterizzate dalla valutazione dell'espressione di MHC Classe 2 e dei marcatori di superficie delle cellule CD86 e CD40 co-stimolatorie hanno convalidato le cellule dendritiche o il fenotipo DC-like. Durante la co-coltura di linfociti MoDC il nono giorno, è stato osservato un cambiamento morfologico che mostra l'estensione dei dendriti nell'impulso RV ai MoDC. Rispetto alla coltura di linfociti MoDC non pulsata, un aumento significativo della proliferazione dei linfociti è stato dimostrato dalla sovraregolazione dei marcatori di attivazione Ki67 e CD25 sulle cellule T CD4 positive e CD8 positive al giorno 16 nella co-coltura di linfociti MoDC pulsati.
Le cellule T CD8 positive delle co-colture mature di MoDC pulsate RV hanno mostrato una sovraregolazione di otto volte di Ki67 rispetto al gruppo non specifico. Le cellule CD4 positive nella stessa co-coltura hanno mostrato un aumento di sette volte di Ki67 rispetto ai controlli, dimostrando la capacità dei MoDC innescati da RV di presentare l'antigene RV ai linfociti naïve e attivarli in una condizione in vitro. La quantificazione qPCR delle co-colture ha mostrato un aumento di oltre il 30% nell'espressione di interferone gamma e di oltre il 5% nell'espressione di Ki67 in tutte le co-colture che hanno utilizzato GAPDH come calibratore.
Una concentrazione significativamente più elevata di interferone gamma secreto è stata osservata nella co-coltura di linfociti MoDC pulsati RV rispetto al gruppo di trattamento non specifico. Eseguire la fase di stratificazione molto lentamente e con attenzione, assicurandosi che il sangue sia posto sopra il mezzo di isolamento dei linfociti. Prestare particolare attenzione a raccogliere tutte le PBMC senza raccogliere troppo materiale dagli altri livelli.
Altri metodi come la citometria a flusso, l'ELISA e la PCR quantitativa, tra gli altri, possono essere applicati dopo questa procedura per valutare l'attivazione dei marcatori immunitari.
