פרוטוקול זה מייצג בדיקה פונקציונלית במבחנה באמצעות תאים דנדריטיים שמקורם במונוציטים של בקר כדי למדוד אימונוגניות של חיסונים לפני מחקרי in vivo. לכן, מילוי פער קיים בחיסון בעלי חיים. זהו הדור והיישום של תאים דנדריטיים.
כתאים מציגי האנטיגן החזקים ביותר, תאים דנדריטיים הפכו ליעד מחקרי מרכזי להבנת מנגנוני חיסון תוך-תאיים, כולל יעילות החיסון. בדיקה זו יכולה להיות מיושמת ככלי לסינון מועמדים לחיסון, כמצב בקרת איכות לייצור חיסונים, ולבחירת אנטיגן ואדג'ובנט. מי שידגים את ההליך יהיה ריצ'רד קנגתה, מדען במעבדה לייצור ובריאות בעלי חיים.
התחל על ידי היפוך וערבוב הדם המתקבל ניקוב הווריד הצווארי של העגל עם vacutainers heparinized. לאחר מכן להעביר 20 מיליליטר של דם heparinized צינור סטרילי 50 מיליליטר לדלל אותו עם 10 מיליליטר של פוספט buffered מלוחים או PBS. פיפטה 15 מיליליטר של בידוד לימפוציטים בינוני לצינור סטרילי 50 מיליליטר להטות את הצינור למצב 45 מעלות.
בזהירות שכבה 30 מיליליטר של דם PBS בינוני על גבי בידוד לימפוציטים באמצעות פיפטה 25 מיליליטר ולאט לאט להחזיר את הצינור למצב אנכי לפני צנטריפוגה אותו. לאחר מכן לאסוף את השכבה הלבנה הדקה של תאים חד גרעיניים דם היקפיים או שכבת PBMC באמצעות פיפטה פסטר ולהעביר אותו לתוך צינור 50 מיליליטר חדש. שטפו את מרכזיות ה-PBMC שנקטפו פעמיים באמצעות 40 מיליליטר PBS לשטיפה וערבבו היטב.
לאחר הצנטריפוגה, להשהות מחדש את הגלולה ב 15 מיליליטר של חיץ אשלגן אמוניום כלורי או חיץ ACK. לאחר 10 עד 15 דקות של דגירה בטמפרטורת החדר, להוסיף עד 40 מיליליטר של PBS וצנטריפוגה את הצינור עם תאוצה והאטה מקסימלית. להשהות את הגלולה ב 10 מיליליטר של מדיום תרבית שלם.
לאחר מכן הוסף חמישה מיקרוליטרים של חיץ CD14 MicroBead לכל 10 מיליון תאים וערבב היטב באמצעות פיפטה. לניתוח ציטומטריית זרימה, הוסף 10 מיקרוליטר של נוגדן מכתים פלואורסצאין CD14 או FITC ל- PBMCs ודגר עליו במשך 15 דקות בארבע עד שמונה מעלות צלזיוס לפני שתמשיך עם ציטומטריית הזרימה. למרכזיות הלא מוכתמות, הוסיפו מיליליטר אחד של מאגר פקס וצנטריפוגו אותו למשך שבע דקות בטמפרטורה של 500 גרם וארבע מעלות צלזיוס.
לאחר מכן להשעות מחדש את הגלולה ב 500 מיקרוליטר של מאגר פקס לכל 100 מיליון תאים. לאחר מכן, הכנס את עמודת הפרדת התאים האימונומגנטית למפריד ומקם צינור איסוף של 50 מיליליטר מתחת לשקע העמוד לאיסוף הזרימה. לאחר שטיפת העמוד עם מאגר פקס נטול גז של מיליליטר אחד, החלף את צינור ה- 15 מיליליטר המשומש בחדש.
פיפטה מאה מיליון תאים ב-500 מיקרוליטר חיץ בכל פעם, מה שמאפשר לתרחיף התא לעבור דרך העמודה. לאחר מכן שטפו את העמוד שלוש פעמים עם שלושה מיליליטר של מאגר פקס נטול גז בכל פעם. לאחר איסוף הזרימה, תייגו את מקטע הלימפוציטים הנאיבי המדולל הראשון כשבר התא השלילי CD14.
מוציאים את העמוד מהמפריד ומניחים צינור סטרילי חדש של 15 מיליליטר מתחת לטור לאיסוף הקולחים. הוסף חמישה מיליליטר של מאגר פקס לעמודה ודחף אותו מיד באמצעות הבוכנה. אסוף ותייג את הזרימה השנייה או את מקטע המונוציטים התמים כשבר התא החיובי CD14.
הוסף מדיום תרבית שלם למונוציטים החיוביים CD14 שנקטפו כדי להשיג 1 מיליון תאים למיליליטר. לאחר מכן, הוסיפו תרחיף של מיליליטר אחד לכל באר של צלחת סטרילית בת 24 בארות לפני שתשלימו כל באר 40 מיקרוליטר של קוקטייל הציטוקינים המסופק בערכה. ביום השני, העבירו מחצית מתכולת כל באר לצינורות בודדים של 1.5 מיליליטר באמצעות פיפטה.
לאחר צנטריפוגה של צינורות 1.5 מיליליטר במשקל 500 גרם למשך שבע דקות, יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של מדיום תרבית שלם טרי. העבר 500 מיקרוליטר של השעיית התא המושעה חזרה לבארות המתאימות, כך שהנפח הסופי בבאר יהפוך למיליליטר אחד. העשירו כל באר ב-20 מיקרוליטר קוקטייל ציטוקינים.
כדי לייצר MoDC בפולסי אנטיגן, יש להוסיף מיקרוליטר אחד למיליליטר של חיסון נגד נגיף הכלבת או תרחיף RV למיליליטר אחד של תרבית תמימה של MoDC בצלחת בת 24 הקידוחים ולדגור על הצלחת במשך 48 שעות ב-5% פחמן דו-חמצני ו-37 מעלות צלזיוס. ביום השביעי, יש לשמור את צלחת 24 הקידוחים המכילה את פעימות האנטיגן MoDCs על קרח למשך 10 דקות לפני הוספת מיליליטר אחד של PBS קר כקרח לכל באר וערבוב יסודי. מעבירים את המתלה לצינור 15 מיליליטר.
לשטוף את הבארות עם שני מיליליטר של PBS קר כקרח. לאסוף את התאים שיורית בתוך כל באר ולהעביר את התוכן שטוף לתוך צינורות המתאימים שלהם. צנטריפוגו את מתלה התא ב-500 גרם למשך שבע דקות.
לאחר השלכת הסופרנטנט, השהה מחדש את כדורית תא MoDCs בפולס אנטיגן בתווך תרבית שלם כדי להתאים את הריכוז הסופי של 100, 000 תאים למיליליטר. עבור תרבית משותפת של לימפוציטים MoDC, זרעו את הבארות של צלחת סטרילית בת 24 בארות עם מיליליטר אחד של תרחיף תאי הלימפוציטים התמים ומיליליטר אחד של תרחיף MoDC בפולס אנטיגן או שאינו דופק אנטיגן ביום השביעי של דופק האנטיגן. לאחר יומיים של דגירה, להשלים כל באר עם 20 ננוגרם למיליליטר רקומביננטי אינטרלוקין-2 ולהמשיך את הדגירה במשך 120 שעות נוספות.
ביום ה-14 מעבירים מיליליטר אחד מהתרבית המשותפת לצינור סטרילי של 1.5 מיליליטר וצנטריפוגה את הצינור. לאחר מכן להשעות מחדש את גלולת התא עם מיליליטר אחד של MoDCs דופקים אנטיגן או לא פועמים. מערבבים היטב ומעבירים את מתלי התאים לבארות המתאימות להם.
לאחר צביעת פני התא של PBMCs ולימפוציטים ומונוציטים נאיביים, מעבירים מיליליטר אחד מתרחיף התא לצינור סטרילי של 1.5 מיליליטר באמצעות פיפטה וצנטריפוגה למשך 10 דקות במשקל 500 גרם. לאחר מכן להשעות את הגלולה במיליליטר אחד של PBS ולהעביר אותו צינור 15 מיליליטר. כמו כן לאסוף את התאים שיורית ואת צינורות המתאימים באמצעות מיליליטר אחד של PBS.
לאחר מכן להוסיף 10 מיליליטר של PBS לצינור 15 מיליליטר המכיל את התאים ולערבב על ידי pipetting. לאחר צנטריפוגה של הצינור במשך שבע דקות במשקל של 850 גרם, מוציאים את הסופרנאטנט ובזהירות משעים מחדש את גלולת התא עם שאריות מתלה שנותרו לאחר פירוק הסופרנטנט. העבירו את מתלה התא לצלחת V בעלת 96 בארות ואטמו את הבארות כדי למנוע שפיכה.
לאחר השלמת הצביעה, בצע את ניתוח ציטומטר הזרימה. מהתצוגה המקדימה בזמן אמת, התאם את סף הפלואורסצנטיות כולל מתח ורווח וגודל התא כדי לצייר בסופו של דבר שערים סביב אוכלוסיית התאים הרצויה תוך אי הכללת פסולת תאית. צביעת תאי CD14 וציטומטריית זרימה הראו כי מקטע המונוציטים התמים כלל 98% תאי מונוציטים חיוביים CD14 והיה מסוגל מבחינה תפקודית לקלוט אנטיגן.
ה-MoDCs הנאיביים שהתאפיינו פנוטיפית בהערכת הביטוי של MHC Class 2 וסמני פני השטח של תאי CD86 ו-CD40 אימתו את התאים הדנדריטיים או את הפנוטיפ דמוי DC. במהלך תרבית לימפוציטים משותפת של MoDC ביום התשיעי, נצפה שינוי מורפולוגי המראה התרחבות דנדריט בדופק RV ל- MoDCs. בהשוואה לתרבית לימפוציטים MoDC ללא פעימות, הודגמה עלייה משמעותית בהתפשטות הלימפוציטים על ידי הגברת הוויסות של סמני ההפעלה Ki67 ו- CD25 על תאי T חיוביים CD4 ו- CD8 חיוביים ביום ה -16 בתרבית משותפת של לימפוציטים MoDC פועמים.
תאי ה-T החיוביים ל-CD8 מתרביות ה-MoDC הבוגרות עם פעימות RV הציגו עלייה של פי שמונה ב-Ki67 בהשוואה לקבוצה הלא ספציפית. התאים החיוביים ל-CD4 באותה תרבית משותפת הראו עלייה של פי שבעה ב-Ki67 בהשוואה לקבוצת הביקורת, מה שמדגים את היכולת של RV primed MoDCs להציג את האנטיגן RV ללימפוציטים נאיביים ולהפעיל אותם במצב של מבחנה. כימות qPCR של תרביות משותפות הראה עלייה של יותר מ-30% בביטוי גמא אינטרפרון ויותר מ-5% בביטוי Ki67 בכל התרביות המשותפות שהשתמשו ב-GAPDH ככיול.
ריכוז גבוה משמעותית של אינטרפרון גמא מופרש נצפה בתרבית הלימפוציטים של RV בפולסים של MoDC בהשוואה לקבוצת הטיפול הלא ספציפית. בצע את שלב השכבות לאט מאוד ובזהירות, להבטיח כי הדם מונח על גבי מדיום בידוד הלימפוציטים. היזהר במיוחד לאסוף את כל PBMCs מבלי לאסוף יותר מדי חומר מהשכבות האחרות.
שיטות אחרות כגון ציטומטריה זרימה, ELISA ו PCR כמותי, בין היתר, ניתן ליישם לאחר הליך זה כדי להעריך את ההפעלה של סמנים חיסוניים.
