حاليا لدينا فهم محدود لبيولوجيا عدوى البلازموديوم في الكبد. لقد ساعدنا هذا البروتوكول في توليد الكثير من الخطوط المعدلة وراثيا التي ساعدت في الإجابة على بعض الأسئلة المهمة حول بيولوجيا الكائن الحي. هناك حاجة إلى فهم أساسي للطفيلي وبيولوجيته لتطوير أدوات ونهج جديدة لمكافحة عدوى الملاريا.
ساعدتنا طريقة الجينات المحورة التي نصفها هنا في فك رموز بعض البيولوجيا الرئيسية والمعقدة للكائن الحي وكذلك المضيف. سيوضح هذا الإجراء كارسون باورز ، مدير مختبري. بعد توليد الفئران المصابة ب P.Bergehei والقتل الرحيم لها ، اجمع ملليلتر من الدم من فأرين مصابين إلى خمسة ملليلتر من محلول Elsevier في بيئة معقمة.
أجهزة الطرد المركزي الدم في 450 غرام لمدة ثماني دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 10 ملليلتر من وسائط RPMI الكاملة. قم بطرد مركزي تعليق الخلية مرة أخرى وأعد تعليق الحبيبات في 25 ملليلتر من وسائط RPMI الكاملة.
انقل تعليق الخلية إلى دورق ثقافة T75 بغطاء مرشح واحتضانه بهز لطيف للحفاظ على الخلايا معلقة. في نهاية الحضانة ، اجمع 500 ميكرولتر من العينة. أجهزة الطرد المركزي وإعادة تعليق الحبيبات في 10 ميكرولتر من وسائط RPMI الكاملة.
بعد ذلك ، تحضير مسحة دم رقيقة. وصمة عار مسحة الدم مع وصمة عار Giemsa وتحديد وتيرة schizonts. لتحقيق الكفاءة المثلى للانتقال ، يجب أن يكون 60 إلى 70٪ من الطفيليات في مرحلة الفصام.
قم بإعداد مخزن مؤقت للطرد المركزي المتدرج عن طريق إعادة تكوين 13 ملليلتر من وسط مخزون تدرج الكثافة في أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر. نقل 25 ملليلتر من ثقافة الدم إلى أنبوب طرد مركزي جديد 50 ملليلتر. ثم ضع بعناية 20 ملليلترا من المخزن المؤقت للطرد المركزي المتدرج إلى أسفل أنبوب الطرد المركزي ، باستخدام ماصة زجاجية ضيقة لإنشاء عمود متدرج وضمان تقسيم واضح بين المخزن المؤقت والوسائط.
أجهزة الطرد المركزي العازلة المعدة والوسائط لمدة 20 دقيقة عند 450 جم مع عدم وجود انقطاع في درجة حرارة الغرفة. باستخدام ماصة المراعي ، قم بإزالة طبقة schizont بعناية في واجهة وسائط الاستزراع والمخزن المؤقت للطرد المركزي المتدرج. ضعه في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 50 ملليلتر.
أعد تعليق schizonts المعزولة في وسائط RPMI كاملة وقم بزيادة الحجم الإجمالي إلى 40 ملليلتر. بعد الطرد المركزي والتخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق schizont في 10 ملليلتر من وسائط RPMI الكاملة. ثم انقل ملليلترا واحدا من هذا المحلول إلى أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 ملليلتر لكل عملية نقل وحبيبات الخلايا المصابة عن طريق الطرد المركزي عند 16،000 جم لمدة خمس ثوان.
بعد ذلك ، ادمج 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتثقيب الكهربائي في درجة حرارة الغرفة مع خمسة ميكروغرام من الحمض النووي للبلازميد المستهدف في أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 ملليلتر. بعد الطرد المركزي للخلايا المصابة ، قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا بعناية في محلول nucleoefector المحضر بالإضافة إلى الحمض النووي البلازميد. ثم انقل التعليق إلى التثقيب الكهربائي ، و cuvettes ، و transfect باستخدام برنامج nucleofector مناسب.
بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من وسائط RPMI الكاملة إلى كوفيت. انقل المحلول بالكامل إلى أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 ملليلتر وضعه على الجليد. تحقق من مستويات الطفيليات في الفئران الملقحة بالفصام المننقل يوميا من يومين بعد التلقيح.
بمجرد تأكيد الإصابة ، ابدأ في اختيار الدواء عن طريق إعطاء الدواء عن طريق الفم ومياه الشرب المقدمة حسب الطلب. يجب مراقبة الطفيليات باستخدام مسحات الدم بدءا من ستة أيام بعد بدء علاج البيروميثيمين. عندما يصل الطفيلي إلى 1٪ على الأقل ، قم بنقل الطفيليات إلى فئران B6 الساذجة لإنشاء مخزون طفيلي في مرحلة الدم.
بمجرد أن يصل الطفيلي إلى 2٪ إلى 5٪ ، قم بتوليد المخزونات والحفاظ عليها بالتبريد. قبل يوم واحد من إصابة البعوض ، افصل أنثى البعوض عن طريق وضع قفاز مملوء بالماء المسخن إلى 37 درجة مئوية فوق القفص الذي يحتوي على كل من البعوض من الذكور والإناث. استخدم شفاط الحشرات لإزالة إناث البعوض المنجذبة إلى مصدر الحرارة ونقلها إلى قفص أصغر للعدوى.
في يوم تغذية البعوض والعدوى ، حدد الطفيليات في الفئران B6 المصابة. الطفيليات بين 2٪ إلى 5٪هو الأمثل لعدوى البعوض. بعد التحقق من طفيلي الدم ، انقل العدوى إلى أنثى البعوض عن طريق وضع الفئران المخدرة على أنثى البعوض المحبوسة تحت راقد القص.
انشر الأرجل الأمامية والخلفية يدويا لتوفير أكبر مساحة سطح لتغذية البعوض. اترك الفئران المصابة في كل قفص لمدة 15 دقيقة ، وتحقق كل خمس دقائق للتأكد من أن الفئران ليست مستيقظة. بمجرد اكتمال التغذية والقتل الرحيم للفئران ، تخلص منها بأمان باتباع إرشادات المؤسسة.
للتحقق من نجاح العدوى داخل البعوض ، اعزل البعوض في منتصف الأمعاء عن طريق إزالة الجزء البطني الطرفي بالملقط بعد 10 أيام من الإصابة. ثم شاهد الأمعاء الوسطى تحت الضوء المستقطب للكشف عن وجود البويضات. في 18 يوما بعد الإصابة ، قم بتشريح خمسة إلى 10 بعوض لتقييم عدد sporozoites الموجودة.
لعزل وحساب sporozoites ، قم بإزالة رأس البعوض بعناية أثناء الضغط على الصدر بالملقط أو إبرة تشريح دقيقة. ستبقى الغدد اللعابية متصلة بالرأس الذي تمت إزالته. بعد ذلك ، قم بإزالة أي حطام إضافي للبعوض من الغدد اللعابية ووضعها في أنبوب طرد مركزي صغير يحتوي على 400 ميكرولتر من وسائط تشريح البعوض.
ثم قم بتعطيل الغدد اللعابية المعزولة عن طريق تمريرها عبر حقنة إبرة قياس 30 من 15 إلى 20 مرة ، وبعد ذلك ، ضع 10 ميكرولتر من الغدد اللعابية المعطلة في وسائط تشريح البعوض في مقياس الدم والعد. أخيرا ، أعد تعليق الغدد اللعابية في التركيز المطلوب لوسائط تشريح البعوض أو PBS للحقن في الفئران أو الحفظ بالتبريد على المدى الطويل. مثل الصور المجهرية التي تصور P.berghei schizont الناضجة وغير الناضجة في ثقافات دم الفأر المتطفلة.
مثل الصور المجهرية لرأس البعوض مع الغدد اللعابية لا تزال سليمة أثناء التشريح ، وتظهر الغدة اللعابية المشرحة تحت التكبير السفلي والأعلى. يشير توليد إشارة مضان خضراء في PB ، GFP 11 المصابة HEPA GFP من واحد إلى 10 خلايا مضيفة إلى تحلل الفجوة الطفيلية. من المهم إزالة طبقة الكرسي بعناية دون تعطيل واجهة التدرج.
أيضا ، يتطلب الأمر القليل من الممارسة لإزالة الغدد اللعابية بشكل موثوق مع الرأس أثناء عزل الجراثيم الخفيفة. بعد العزل ، يمكن حفظ الأسبوروزويتات المعدلة وراثيا بالتبريد أو استخدامها طازجة في دراسات العدوى في الجسم الحي أو في المختبر.
