فإن الكتاب أود أن أشكر الآنسة ليانا Mackiewicz للمساعدة التقنية. وقدم هذا العمل ممكنا من خلال دعم حكومة الولاية الفيكتوري البنية التحتية التشغيلية والحكومة الأسترالية الوطنية للصحة والبحوث الطبية IRIISS المجلس ومشروع منح 1031212.

1. إصابة الفئران مع P. berghei-ANKA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقسامة من تذويب P. cryopreserved berghei ANKA pRBC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كبح الدماغيه الملاريا المقاومة للالماوس المانحة BALB / ج (8-12 أسابيع من العمر) باستخدام تقنية ضبط النفس باليدين. حقن الماوس مع 100-200 ميكرولتر من استخدام الأنسولين pRBC 1 مل حقنة (إبرة 28G). بشكل روتيني، يتم حقن الفئران المانحة 1-2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على بعد 4-5 أيام العدوى (PI) إزالة الماوس المانحة من القفص ووضعه على محطة عمل أو لوحة المتاح العمل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كبح بلطف الماوس في نهاية الذيل وباستخدام مقص صغير قطع رأس الذيل (حوالي 1 ملم). وبدلا من ذلك، يمكن أن يقوم ثقب صغير الذيل باستخدام إبرة G 25. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قطرة من الدم من الوريد ذيل الماوس بالقرب من نهاية شريحة المجهر بلوري النهائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع شريحة الثانية (رش) على زاوية 45 درجة ودعمه في قطرة من الدم. مرة واحدة في الدم ينتشر على طول الحافة، ودفع عشية رش الشريحةنلي عبر المجهر الشريحة لجعل مسحة الدم. السماح للتشويه للهواء الجاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح مسحات الدم في الميثانول بنسبة 100٪ لمدة 30 ثانية ثم وصمة عار في بالغيمزا الشرائح الطازجة لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف مع مسحة الدم المياه الجارية لمدة 1 دقيقة، السماح ليجف في الهواء وفحص الشريحة تحت المجهر (الغمر النفط 100X،). تعداد الكريات الحمراء pRBC داخل 1000 وحساب تطفلن الدم في المئة. يجب أن تصل إلى مستويات الفئران المانحة تطفلن الدم بين 2،5-5٪ قبل أن يتم نزف للإصابة حيوانات التجارب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الدم من الجهات المانحة عن طريق الماوس الرجعية المدارية النزيف باستخدام heparinized الدقيقة الهيماتوكريت أنبوب شعري. يتم تنفيذ جميع التجارب في الامتثال لوالتر وإليزا هول معهد متطلبات الحيوان جنة الأخلاقيات. قد اعتمادا على المتطلبات المحلية الحيوان جنة الأخلاق أن تستخدم الإجراءات الدموية الأخرى. حل الكمية المطلوبة من الدم في المتوسط ​​RPMI في تركيز النهائي من مل 6 pRBC/0.2 1X10. نعتبر أنوالهيماتوكريت الماوس العادي ~ 6x10 9 خلايا الدم الحمراء / 1 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصيب C57BL التجريبية / 6 الفئران (8-12 أسابيع من العمر) عن طريق حقن الغشاء البريتونى (IP) 1x10 6 pRBC/0.2 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطفلن الدم لرصد مستويات من الفئران المصابة اتبع الخطوات من 1،3-1،8. وينبغي أن تحدد كل 2-3 أيام تطفلن الدم بدءا من اليوم 2 أو 3 بي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطوقية بداية الملاريا الحادة في C57BL / 6 الفئران قد تظهر كما مظهر التقوس والفراء وقليلة النشاط. قد يكون بعض الفئران استرداد في هذه المرحلة، ولكن التقدم إلى فقدان الذات المنعكس التقويمي يشير المرض لا رجعة فيه، ويجب أن يتم التخلص الحيوانات. </li></ol> 2. Intracardial الإرواء من الفئران واستخراج الدماغ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع نضح خطورة دليل النظام من خلال تأمين خزان 500 مل إلى صاحب عمود تعلق على الجزء العلوي من العمود موقفا 60 سم. الاتصال أنابيب بلاستيكية إلى نهاية الجزء السفلي من الخزان وتأمين أنابيب المشبك للتحكم في تدفق العازلة. نعلق أنابيب إلى إبرة G 23. فيلل يصل الخزان مع PBS (C ° الاحتفاظ بها في 22)، افتح المشبك والسماح لتشغيل المخزن المؤقت من خلال أنابيب لإزالة جميع فقاعات الهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء P. berghei ANKA المصابين الماوس عن طريق الاستنشاق 2 CO. تأكيد وفاة بسبب غياب دواسة، المدارية والردود في الجهاز التنفسي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دبوس الماوس الموت الرحيم من قبل الكفوف هند وأمام ظهريا على لوحة تشريح الستايروفوم الواردة في علبة من البلاستيك. يمكن اعتمادا على تخدير موضعي الأخلاق الحيوانية متطلبات اللجنة أن تدار بدء مسبقة من pefusion intracardial. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسح الجانب البطني مع الايثانول 70٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مقص وملقط كبير لفتح الجلد على طول خط الوسط لفضح تجويف الصدر. أضعاف، ودبوس الجلد على الجانبين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد القص مع ملقط الغرامة وخفض الحجاب الحاجز وعلى طول جانبي القص قطع الأضلاع. والحرص على عدم إتلاف أي الأوعية الدموية الكبيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دبوس القفص الصدري بواسطة القص المقبل فضفاضة في الرأس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد البطينين الطرافةح ملقط غرامة والأذين الأيمن شق بعناية مع مقص غرامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج إبرة 23G تعلق على نظام نضح جاذبية في البطين الأيسر والشريان الأورطي نحو تصاعدي في حين PBS قيد التشغيل. إدراج 0.5 سم فقط من طرف الإبرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يروي الماوس لمدة 5 دقائق أو حتى النفايات السائلة واضح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بفصل الماوس ووضع على البطن. مسح الرأس مع الايثانول 70٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مقص كبير، وجعل قطع فقط فوق منطقة النخاع الشوكي عنق الرحم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مقص غرامة لجعل متوسط ​​الذيلية-منقاري قطع ابتداء من قاعدة الجمجمة وقشر الجلد بعيدا لفضح الجمجمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد رئيس، ضع شفرات مقص صغير لفي كل جوف الحجاج وتقديم قطع بين المدارات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل خفض طولية على طول الدرز السهمي وقشر بعناية الجمجمة على كل نصف الكرة المخ الخارج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملعقة، ورفع بلطف الدماغ ووضعه في أنبوب الطرد المركزي 10 مل تحتوي على RPMI المتوسط. </li></ol>3. عزل الدماغ المعزول الكريات البيضاء (BSL) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العمل في مجلس الوزراء السلامة، والمكان المقطوع حديثا الدماغ على رأس مصفاة الفولاذ المقاوم للصدأ الخلية (40-60 حجم فتحات الشباك) في طبق بتري تحتوي على 3-5 مل من الأنسجة RPMI متوسطة الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع أنسجة المخ إلى أجزاء صغيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دفع قطع صغيرة من أنسجة المخ من خلال مصفاة الخلية باستخدام المكبس وضوح الشمس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل جناسة الدماغ إلى أنبوب الطرد المركزي 10 مل وعند 250 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل بيليه في 3 مل من المتوسط ​​RPMI، تحتوي على 0.05٪ كولاجيناز D و2U/ml I. الدناز </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدوير الخليط لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة الحطام الخلية عن طريق دفع الخليط من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر النايلون و / أو عن طريق احتضان على الجليد لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع جناسة الدماغ على وسادة مل 7 Percoll 30٪ وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ج (بلا فرامل) لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق بيليه في 1 مل من الدم الحمراء الخلية تحلل العازلة واحتضان على الجليد لمدة 5 دقائق إلىليز pRBC تمسكا، والتي لا يمكن إزالتها من الدماغ عن طريق نضح intracardial. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أضف 9 مل من المتوسط ​​RPMI، وغسل الخلايا وأجهزة الطرد المركزي في 250 x ج لمدة 10 دقيقة في C. ° 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق BSL التي تحتوي على بيليه في 50-100 ميكرولتر من الخلايا المتوسطة RPMI ونقل إلى أنبوب إيبندورف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة تخفيف من 5-10 ميكرولتر من العينة خلية باللون الأزرق التريبان 01:02 لتحديد خلايا قابلة للحياة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد خلايا قابلة للحياة تحت المجهر باستخدام عدادة الكريات. ابتداء من اليوم بي 6، عندما P. berghei ANKA الفئران المصابة عرض علامات العصبية، يمكن استرداد 20،000-100،000 BSLs. </li></ol> 4. المناعي الظاهري من BSL من قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 250 XG الخلايا لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية، ونضح طاف بيليه و resuspend في 50 ميكرولتر من العازلة تلطيخ (PBS، 1٪ مصل العجل الجنين (FCS)، 2 مم EDTA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ميكرولتر 1 من تنقية anti-CD16/32 الأجسام المضادة (Fcblock). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان خلايا لمدة 10 دقيقة على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع 1 مل من الاحتياطي تلطيخ. أجهزة الطرد المركزي في 250 XG الخلايا لمدة 10 دقيقة في C ° 4 و نضح طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق الخلايا في 50 ميكرولتر من العازلة التي تحتوي على تلطيخ محددة مسبقا التخفيفات الأمثل من الأجسام المضادة المطلوبة الفلورسنت، أي المضادة للCD4، ومكافحة CD8، ومكافحة TCR ومكافحة NK1.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 1 ساعة على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع 1 مل من الاحتياطي تلطيخ. أجهزة الطرد المركزي في 250 XG الخلايا لمدة 10 دقيقة في C ° 4 و نضح طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخلايا إلى أنبوب تدفق البلاستيك الخلوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام قياس التدفق الخلوي، والحصول على ما لا يقل عن 5،000-10،000 الأحداث. وينبغي أن تدرج الضوابط المناسبة الخلية غير ملوثين وعينات التعويض ملون تألقي كما هو مطلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل النتائج باستخدام البرمجيات المناسبة التدفق الخلوي. </li></ol>

<ol>
	<li>Brian de Souza, J., Riley, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+malaria:+the+contribution+of+studies+in+animal+models+to+our+understanding+of+immunopathogenesis.">Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis.</a> Microbes and Infection. 4, 291-300 (2002).</li><li>Schofield, L., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+processes+in+malaria+pathogenesis.">Immunological processes in malaria pathogenesis.</a> Nature. 5, 722-735 (2005).</li><li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenic+basis+of+malaria.">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415, 673-679 (2002).</li><li>Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+monocytes+damage+the+hippocampus+during+acute+picornavirus+infection+of+the+brain.">Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain.</a> Journal of neuroinflammation. 9, 50 (2012).</li><li>LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Brain-infiltrating+Leukocytes.">Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes.</a> J. Vis. Exp. (52), e2747 (2011).</li><li>Lim, S. M., Koraka, P., Osterhaus, A. D., Martina, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=West+Nile+virus:+immunity+and+pathogenesis.">West Nile virus: immunity and pathogenesis.</a> Viruses. 3, 811-828 (2011).</li><li>Belnoue, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+pathogenic+role+of+brain-sequestered+alphabeta+CD8++T+cells+in+experimental+cerebral+malaria.">On the pathogenic role of brain-sequestered alphabeta CD8+ T cells in experimental cerebral malaria.</a> Journal of Immunology. 169, 6369-6375 (2002).</li><li>Campanella, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+receptor+CXCR3+and+its+ligands+CXCL9+and+CXCL10+are+required+for+the+development+of+murine+cerebral+malaria.">Chemokine receptor CXCR3 and its ligands CXCL9 and CXCL10 are required for the development of murine cerebral malaria.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 105, 4814-4819 (2008).</li><li>Hansen, D. S., Bernard, N. J., Nie, C. Q., Schofield, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NK+cells+stimulate+recruitment+of+CXCR3++T+cells+to+the+brain+during+Plasmodium+berghei-mediated+cerebral+malaria.">NK cells stimulate recruitment of CXCR3+ T cells to the brain during Plasmodium berghei-mediated cerebral malaria.</a> Journal of Immunology. 178, 5779-5788 (2007).</li><li>Amante, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+natural+regulatory+T+cells+in+the+pathogenesis+of+experimental+cerebral+malaria.">A role for natural regulatory T cells in the pathogenesis of experimental cerebral malaria.</a> The American journal of pathology. 171, 548-559 (2007).</li><li>Nie, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP-10-mediated+T+cell+homing+promotes+cerebral+inflammation+over+splenic+immunity+to+malaria+infection.">IP-10-mediated T cell homing promotes cerebral inflammation over splenic immunity to malaria infection.</a> PLoS pathogens. 5, e1000369 (2009).</li><li>Franke-Fayard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+malaria+parasite+sequestration:+CD36+is+the+major+receptor,+but+cerebral+pathology+is+unlinked+to+sequestration.">Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 11468-11473 (2005).</li><li>Nitcheu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforin-dependent+brain-infiltrating+cytotoxic+CD8++T+lymphocytes+mediate+experimental+cerebral+malaria+pathogenesis.">Perforin-dependent brain-infiltrating cytotoxic CD8+ T lymphocytes mediate experimental cerebral malaria pathogenesis.</a> Journal of Immunololgy. 170, 2221-2228 (2003).</li><li>Lundie, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-stage+Plasmodium+infection+induces+CD8++T+lymphocytes+to+parasite-expressed+antigens,+largely+regulated+by+CD8alpha++dendritic+cells.">Blood-stage Plasmodium infection induces CD8+ T lymphocytes to parasite-expressed antigens, largely regulated by CD8alpha+ dendritic cells.</a> Proceeding of the National Academy of Science U S A. 105, 14509-14514 (2008).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

عزل وتحليل BSL هو وسيلة تسمح توصيف وتقدير من الخلايا الالتهابية الهجرة إلى الدماغ استجابة لإصابة الأنسجة أو العدوى في نماذج الماوس التجريبية. إدخال خطوة نضح intracardial لإزالة المقصورة الدم قبل استخراج الجهاز والعزلة اللاحقة خلية مفيد لمنع التلوث من الخلايا الالتهابية م?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> التعليقات (اختياري) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> حلول ومخازن </td></tr><tr><td> بالغيمزا في الميثيلين الأزرق حل يوزين دازور </td><td> ميرك ميليبور </td><td> 1.09204.0500 </td><td> 1:10 التخفيف في الماء المقطر </td></tr><tr><td> RPMI متوسطة </td><td></td><td></td><td> الماوس تحظرب </td></tr><tr><td> الماوس تحظرب PBS </td><td></td><td></td><td> 20 ملي فوسفات الصوديوم، كلوريد الصوديوم 0،149، ودرجة الحموضة 7.3 </td></tr><tr><td> التريبان الأزرق 0.4٪ </td><td> سيغما الدريتش </td><td> T-8154 </td><td> 01:02 التخفيف </td></tr><tr><td> كولاجيناز D </td><td> الكيمياء الحيوية ورثينجتون </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Deoxyribonuclease (الدناز) I </td><td> سيغما الدريتش </td><td> D4263-5VL </td><td> من البنكرياس البقري </td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE للرعاية الصحية </td><td> 17-0891-01 </td><td> حل 30٪ في برنامج تلفزيوني </td></tr><tr><td> عالى النقاء تريس </td><td> إينفيتروجن </td><td> 15505-020 </td><td></td></tr><tr><td> كلوريد الأمونيوم (NH 4 CL) </td><td> AnalaR </td><td> 10017 </td><td></td></tr><tr><td> الاحتياطي انحلال الخلايا الحمراء </td><td></td><td></td><td> 17 ملم تريس، 14nM NH 4 الكلورين، ودرجة الحموضة 7.2 </td></tr><tr><td> FCS </td><td> Gibco </td><td> 1009 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA ثنائي الصوديوم الملح </td><td> ميرك </td><td> 10093.5V </td><td> 0.1M، ودرجة الحموضة 7.2 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> الأجسام المضادة وتقارن </td></tr><tr><td> مكافحة الماوس CD16/CD32 (FC بلوك)، استنساخ 2.4G2 </td><td> BD Pharmingen </td> &lt;TD&gt; 553142 </td><td> 1 ميكرولتر العازلة في 50 ميكرولتر تلطيخ (0.5mg/50 مل) </td></tr><tr><td> FITC مكافحة الماوس CD4، استنساخ H129.19 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553651 </td><td></td></tr><tr><td> PE-الماوس المضادة للNK1.1، استنساخ PK136 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553165 </td><td></td></tr><tr><td> PerCPCy5.5 مكافحة الماوس CD8، استنساخ 53-6-7 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 551162 </td><td></td></tr><tr><td> APC-الماوس المضادة للTCR-β، استنساخ H57-597 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553174 </td><td></td></tr><tr><td> PE-الماوس المضادة للCXCR3، استنساخ 220803 </td><td> R &amp; D أنظمة </td><td> FAB1685P </td><td></td></tr><tr><td> المعقدة البيروكسيديز مكافحة الماوس CCR5، استنساخ C34-3448 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559922 </td><td></td></tr><tr><td> Steptavidin-PerCP-Cy5.5 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 551419 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> المعدات والمواد </td></tr><tr><td> SuperFrost المجهر الشريحة </td><td> ومب منزل-جلاسر </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ملقط تشريح، مقص </td><td> REDA INSTRUMENTE </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 500 مل PBS الخزان </td><td> Nalgene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> المطاط أنابيب </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 23G إبرة </td><td> BD PrecisionGlide </td><td> 302008 </td><td></td></tr><tr><td> الخلية التي تحتوي على المعادن التفكك عدة غربال </td><td> سيغما الدريتش </td><td> CD-1 </td><td></td></tr><tr><td> 70 ميكرومتر مصفاة الخلية النايلون </td><td> BD الصقر </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> عدادة الكريات </td><td> شركة محدودة نويباور </td><td> 717810 </td><td></td></tr><tr><td> أنابيب تدفق الخلوي </td><td> BD الصقر </td><td> 352008 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and analysis of brain-sequestered leukocytes from plasmodium berghei anka-infected mice

وصفنا طريقة لعزل وتوصيف الخلايا الالتهابية تمسكا من الأوعية الدموية في الدماغ من P. berghei ANKA المصابين الفئران. إصابة السلالات الحساسة الفأر مع هذه النتائج سلالة الطفيلي في استحثاث الملاريا الدماغية التجريبية، وهي متلازمة عصبية أن يجمل جوانب هامة معينة من الملاريا المنجلية المتصورة بوساطة شديد في 1،2 البشر. أشكال ناضجة من الدم في مرحلة التعبير عن الملاريا الطفيلية البروتينات على سطح كرات الدم الحمراء للمصاب، مما يسمح لهم لربط الخلايا البطانية في الأوعية الدموية. هذه العملية يدفع عوائق في تدفق الدم، مما يؤدي إلى نقص الأكسجة والنزيف 3 و يحفز أيضا تجنيد الكريات البيض الالتهابية إلى موقع تنحية الطفيليات. على عكس غيره من الأمراض والفيروسات neutrotopic أي 4-6، على حد سواء الملاريا الطفيلي خلايا الدم الحمراء (pRBC) وكذلك يرتبط بها من inflammالكريات البيض atory تبقى المحتبسة داخل الأوعية الدموية بدلا من التسلل لحمة الدماغ. وبالتالي لتجنب التلوث من الكريات البيض مع المنظمات غير المعزول للالتهابات الخلايا المنتشرة، نضح intracardial واسعة من الفئران المصابة قبل استخراج الجهاز ومعالجة الأنسجة هو مطلوب في هذا الإجراء لإزالة الدم المقصورة. بعد نضح، ويتم حصاد العقول وتشريح في قطع صغيرة. وتعطلت كذلك بناء الأنسجة عن طريق العلاج الأنزيمية مع collagenase وI. D الدناز يتم طرد جناسة الدماغ ثم الناتجة عن الانحدار الذي يسمح Percoll الفصل بين الدماغ المعزول الكريات البيض (BSL) من المايلين وغيرها من الحطام الأنسجة. عد الخلايا ثم تغسل المعزولة، وذلك باستخدام عدادة الكريات والملون مع الأجسام المضادة للتحليل الفلورسنت اللاحقة التي التدفق الخلوي. هذا الإجراء يسمح توصيف المظهري شاملة من الكريات البيض الالتهابية الهجرة إلى الدماغ في إعادةاالستجابة للمؤثرات المختلفة، بما في ذلك السكتة الدماغية وكذلك العدوى الفيروسية أو الطفيلية. الأسلوب يوفر أيضا أداة مفيدة لتقييم العلاجات المضادة للالتهابات رواية في النماذج الحيوانية ما قبل السريرية.

النتائج في الشكل. عرض النسب المئوية (2) والأعداد المطلقة للسكان BSL مختلفة تعافى من أدمغة الفئران perfused أو unperfused مكافحة الملاريا المصابين والسذاجة. كانت ملطخة معزولة BSL مع PE-المضادة للNK1.1 والأجسام المضادة APC-المضادة للTCR-β كما هو مشار إليه في نص البروتوكول. تتألف خلايا T <sup...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice at JoVE.com

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

وهناك طريقة لعزل الكريات البيض التهابات الأوعية الدموية الملتصقة من الدماغ من<em&gt; المتصورة berghei</emيوصف&gt; ANKA الفئران المصابة. الأسلوب الكمي يسمح كذلك توصيف المظهري من الكريات البيض المعزولة بعد تلطيخ مع الأجسام المضادة وتحليل الفلورسنت اللاحقة التي التدفق الخلوي.

العزلة وتحليل الدماغ المعزول من الكريات البيضاء<em&gt; المتصورة berghei</em&gt; ANKA الفئران المصابة

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

isolation-analysis-brain-sequestered-leukocytes-from-plasmodium

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

12.7K Views.  The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research. وهناك طريقة لعزل الكريات البيض التهابات الأوعية الدموية الملتصقة من الدماغ من المتصورة berghei ANKA الفئران المصابة. الأسلوب الكمي يسمح كذلك توصيف المظهري من الكريات البيض المعزولة بعد تلطيخ مع الأجسام المضادة وتحليل الفلورسنت اللاحقة التي التدفق الخل...

Video: Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV) via a rapid intracranial injection technique and how to purify a leukocyte-enriched population of infiltrating cells from whole brain. Briefly, mice are anesthetized with isoflurane in a closed chamber and are free-hand injected with a Hamilton syringe into the frontal cortex. Mice are then killed at various times after infection by isoflurane overdose and whole brains are extracted and homogenized in RPMI with a Tenbroeck tissue grinder. Brain homogenates are centrifuged through a continuous 30% Percoll gradient to remove the myelin and other cell debris. The cell suspension is then strained at 40 &mu;m, washed and centrifuged on a discontinuous Ficoll-Paque Plus gradient to select and purify the leukocytes. The leukocytes are then washed and resuspended in appropriate buffers for immunophenotyping by flow cytometry. Flow cytometry reveals a population of innate immune cells at the early stages of infection in C57BL/6 mice. At 24 hours post infection, multiple subsets of immune cells are present in the BILs, with an enriched population of Gr1+, CD11b+ and F4/80+cells. Therefore, this method is useful in characterizing the immune response to acute infection in the brain.

A rapid method to obtain infiltrating leukocytes from the murine brain is described. This method utilizes a continuous Percoll gradient and discontinuous Ficoll gradient to select and purify the leukocyte-enriched layer. Isolated leukocytes may then be characterized by flow cytometric measurements.

عزل الكريات البيضاء في الدماغ التسلل

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the respective immune response to each single pathogen and may thereby affect pathogenesis and disease outcome. Coinfected patients may also respond differentially to anti-infective interventions. Coinfection between tuberculosis as caused by mycobacteria and the malaria parasite Plasmodium, both of which are coendemic in many parts of sub-Saharan Africa, has not been studied in detail. In order to approach the challenging but scientifically and clinically highly relevant question how malaria-tuberculosis coinfection modulate host immunity and the course of each disease, we established an experimental mouse model that allows us to dissect the elicited immune responses to both pathogens in the coinfected host. Of note, in order to most precisely mimic naturally acquired human infections, we perform experimental infections of mice with both pathogens by their natural routes of infection, i.e. aerosol and mosquito bite, respectively.

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Tuberculosis and malaria are two of the most prevalent infections in humans and major causes of morbidity and mortality in impoverished populations in the tropics. We established an experimental model system to study outcome of malaria-tuberculosis coinfection in mice after challenge with both pathogens via their natural route of infection.

نموذج تجريبي لدراسة الملاريا والسل عدوى مرافقة على انتقال الطبيعية السل المتفطرة و المتصورة berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and neurodegenerative diseases but assessing changes in bioenergetic function in patients is challenging.&#160;Although diseases such as diabetes or atherosclerosis present clinically with specific organ impairment, the systemic components of the pathology, such as hyperglycemia or inflammation, can alter bioenergetic function in circulating leukocytes or platelets. This concept has been recognized for some time but its widespread application has been constrained by the large number of primary cells needed for bioenergetic analysis.&#160;This technical limitation has been overcome by combining the specificity of the magnetic bead isolation techniques, cell adhesion techniques, which allow cells to be attached without activation to microplates, and the sensitivity of new technologies designed for high throughput microplate respirometry.&#160;An example of this equipment is the extracellular flux analyzer. Such instrumentation typically uses oxygen and pH sensitive probes to measure rates of change in these parameters in adherent cells, which can then be related to metabolism. Here we detail the methods for the isolation and plating of monocytes, lymphocytes, neutrophils and platelets, without activation, from human blood and the analysis of mitochondrial bioenergetic function in these cells. In addition, we demonstrate how the oxidative burst in monocytes and neutrophils can also be measured in the same samples. Since these methods use only 8-20 ml human blood they have potential for monitoring reactive oxygen species generation and bioenergetics in a clinical setting.

Blood leukocytes and platelets can be used as a marker of overall bioenergetic health of an individual and so have the potential to monitor pathological processes and the impact of treatments. Here&#160;we describe a method to isolate and measure mitochondrial function and the oxidative burst in these cells.

الطاقة الحيوية والأكسدة انفجار: بروتوكولات لعزل وتقييم الكريات البيضاء والصفائح الدموية البشرية

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we describe two in vitro &#8220;vascular&#8221; models for studying the recruitment of circulating neutrophils from flow by inflamed endothelial cells. A major advantage of these models is the ability to analyze each step in the leukocyte adhesion cascade in order, as would occur in vivo. We also describe how both models can be adapted to study the role of stromal cells, in this case mesenchymal stem cells (MSC), in regulating leukocyte recruitment.
Primary endothelial cells were cultured alone or together with human MSC in direct contact on Ibidi microslides or on opposite sides of a Transwell filter for 24 hr. Cultures were stimulated with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) for 4 hr and incorporated into a flow-based adhesion assay. A bolus of neutrophils was perfused over the endothelium for 4 min. The capture of flowing neutrophils and their interactions with the endothelium was visualized by phase-contrast microscopy.
In both models, cytokine-stimulation increased endothelial recruitment of flowing neutrophils in a dose-dependent manner. Analysis of the behavior of recruited neutrophils showed a dose-dependent decrease in rolling and a dose-dependent increase in transmigration through the endothelium. In co-culture, MSC suppressed neutrophil adhesion to TNF&#945;-stimulated endothelium.
Our flow based-adhesion models mimic the initial phases of leukocyte recruitment from the circulation. In addition to leukocytes, they can be used to examine the recruitment of other cell types, such as therapeutically administered MSC or circulating tumor cells. Our multi-layered co-culture models have shown that MSC communicate with endothelium to modify their response to pro-inflammatory cytokines, altering the recruitment of neutrophils. Further research using such models is required to fully understand how stromal cells from different tissues and conditions (inflammatory disorders or cancer) influence the recruitment of leukocytes during inflammation.

The ability of inflamed endothelium to recruit leukocytes from flow is regulated by mesenchymal stromal cells. We describe two in vitro models incorporating primary human cells that can be used to assess neutrophil recruitment from flow and examine the role that mesenchymal stromal cells play in regulating this process.

تحليل آثار خلايا انسجة على تجنيد الكريات البيض من التدفق

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua parietalis). This interface is the anatomical site of contact between maternal and fetal tissues; therefore, it is an immunological site of action during pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface play a central role in implantation, pregnancy maintenance, and timing of delivery. Therefore, phenotypic and functional characterizations of these leukocytes will provide insight into the mechanisms that lead to&#160;pregnancy disorders. Several protocols have been described in order to isolate infiltrating leukocytes from the decidua basalis and decidua parietalis; however, the lack of consistency in the reagents, enzymes, and times of incubation makes it difficult to compare these results. Described herein is&#160;a novel approach that combines the use of gentle mechanical and enzymatic dissociation techniques to preserve the viability and integrity of extracellular and intracellular markers in leukocytes isolated from the human tissues at the maternal-fetal interface. Aside from immunophenotyping, cell culture, and cell sorting, the future applications of this protocol are numerous and varied. Following this protocol, the isolated leukocytes can be used to determine DNA methylation, expression of target genes, in vitro leukocyte functionality (i.e., phagocytosis, cytotoxicity, T-cell proliferation, and plasticity, etc.), and the production of reactive oxygen species at the maternal-fetal interface. Additionally, using the described protocol, this laboratory has been able to describe new and rare leukocytes at the maternal-fetal interface.

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

عزل الكريات البيضاء من واجهة الإنسان الأم والجنين

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing fetus. This tolerance is initiated during coitus, established during fecundation and implantation, and maintained throughout pregnancy. Active cellular and molecular mediators of maternal-fetal tolerance are enriched at the site of contact between fetal and maternal tissues, known as the maternal-fetal interface, which includes the placenta and the uterine and decidual tissues. This interface is comprised of stromal cells and infiltrating leukocytes, and their abundance and phenotypic characteristics change over the course of pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface include neutrophils, macrophages, dendritic cells, mast cells, T cells, B cells, NK cells, and NKT cells that together create the local micro-environment that sustains pregnancy. An imbalance among these cells or any inappropriate alteration in their phenotypes is considered a mechanism of disease in pregnancy. Therefore, the study of leukocytes that infiltrate the maternal-fetal interface is essential in order to elucidate the immune mechanisms that lead to pregnancy-related complications. Described herein is a protocol that uses a combination of gentle mechanical dissociation followed by a robust enzymatic disaggregation with a proteolytic and collagenolytic enzymatic cocktail to isolate the infiltrating leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface. This protocol allows for the isolation of high numbers of viable leukocytes (&#62;70%) with sufficiently conserved antigenic and functional properties. Isolated leukocytes can then be analyzed by several techniques, including immunophenotyping, cell sorting, imaging, immunoblotting, mRNA expression, cell culture, and in vitro functional assays such as mixed leukocyte reactions, proliferation, or cytotoxicity assays.

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

عزل الكريات البيض من أنسجة الفئران في واجهة الأم والجنين

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

عزل التسلل الكريات البيض من ماوس الجلد عن طريق الأنزيمية دايجست والفصل التدرج

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

العزلة وتحليل تدفق Cytometric من الخلايا المناعية من الدماغ الدماغية ماوس

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly motile parasite not only reaches the liver to invade hepatocytes and transform into erythrocyte-infective form. It also migrates into the skin and to the proximal lymph node draining the injection site, where it can be recognized and degraded by resident and/or recruited myeloid cells. Intravital imaging reported the early recruitment of brightly fluorescent Lys-GFP positive leukocytes in the skin and the interactions between sporozoites and CD11c+ cells in the draining lymph node. We present here an efficient procedure to recover, identify and enumerate the myeloid cell subsets that are recruited to the mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of immunizing doses of sporozoites in a murine model. Phenotypic characterization using multi-parametric flow cytometry provides a reliable assay to assess early dynamic cellular changes during inflammatory response to Plasmodium infection.

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

النخاعي عزل الخلايا من الجلد ماوس وتصريف العقدة الليمفاوية بعد الأدمة التحصين مع لايف الموهن<em&gt; المتصورة</em&gt; Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

Selective Harvesting of Marginating-hepatic Leukocytes

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Specifically, evidence suggests a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MH-leukocyte population and higher cytotoxicity of liver-specific NK cells (namely, pit cells) compared to circulating or splenic immunocytes in both mice and rats. The method presented herein enables selective harvesting of MH leukocytes by forced perfusion of the liver in mice and rats. In contrast to other methods used to extract liver-leukocytes, including tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the liver sinusoids, uncontaminated by cells from other liver compartments. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MH leukocytes, sparing known physiological responses to tissue processing. As many circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the liver sinusoids, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes, the unique MH leukocyte population is strategically located to interact, identify, and react towards aberrant circulating cells. Thus, selective harvesting of MH-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of the biological and clinical significance of MH leukocytes, specifically with respect to circulating aberrant cells and liver-related diseases and cancer metastases.

Marginating-hepatic leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe a method for selective harvesting of this specific hepatic cell population, through forced perfusion of the liver of rats or mice. Marginating-hepatic leukocytes seem critical in determining susceptibility to hepatic-related diseases and metastases.

حصاد الانتقائي للMarginating-الكبدية الكريات البيضاء

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics ...