أكد البروتوكول الموضح على النهج التجريبي المباشر والفعال والخطوات التفصيلية لتأثيرات الاستجابة المناعية للمواد المساعدة الفيروسية الجديدة. يوفر هذا البروتوكول للبحث ليس فقط طريقة تقييم مناعية أساسية للقاح المساعد ولكن يمكنه أيضا تحديد استقرار كتلتها. للبدء ، خذ 10 ملليغرام لكل ملليلتر من محلول العمل من بروتين مستضد MRSA HI ، وأضف إليه بالتتابع السواغات الثلاثة ، الآيزوبروبيل ميريستات ، زيت الخروع البولي أوكسي إيثيلين ، والبروبيلين غليكول ، مع الحفاظ على نسبة كتلة من واحد إلى ستة إلى ثلاثة.
حرك الخليط جيدا ، ثم أضف الماء النقي المعقم تدريجيا للوصول إلى حجم نظام 10 ملليلتر. لتحضير لقاح المستحلب النانوي بطريقة الاستحلاب منخفضة الطاقة ، قم بتحريكه بمعدل 500 دورة في الدقيقة و 25 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة تقريبا. بعد ذلك ، يتم الحصول على لقاح المستحلب النانوي الذي يحتوي على ملليغرام واحد لكل ملليلتر من البروتين كسائل شفاف واضح.
بالنسبة لطلاء المستضد لمقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم أو لوحة ELISA ، قم بتخفيف مستضد بروتين HI إلى 10 ميكروغرام لكل ملليلتر بمحلول طلاء ، وأضف 100 ميكرولتر من المستضد المخفف لكل بئر في لوحة ELISA. احتضان اللوحة عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. بعد الحضانة ، اغسل اللوحة ب 300 ميكرولتر من PBST لكل بئر.
سد الآبار ب 300 ميكرولتر من محلول الختم لكل بئر لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية ، ثم تمييع ثلاثة ميكرولتر من مصل الفئران من كل مجموعة تجريبية 100 مرة بإضافة 297 ميكرولتر من PBST ، ودوامة المصل المخفف. أضف 100 ميكرولتر من المصل المخفف لكل بئر في لوحة ELISA المطلية لكل عينة مصل. وبالمثل ، قم بتخفيف أمصال التحكم الإيجابية والسلبية 100 مرة باستخدام PBST عن طريق إضافة أربعة ميكرولترات من مصل التحكم الإيجابي أو السلبي إلى 396 ميكرولتر من PBST ، متبوعا بخلط الدوامة.
لإجراء تخفيف مزدوج النسبة ، أضف 200 ميكرولتر من المصل التجريبي المخفف مسبقا إلى الصف الأول من لوحة ELISA المطلية ، ثم أضف 100 ميكرولتر من PBST إلى جميع الآبار ، باستثناء تلك الموجودة في الصفين الأول و 12. بعد ذلك ، اضبط مسدس الماصة على 100 ميكرولتر ونقل 100 ميكرولتر من المصل من الصف الأول إلى الصف الثاني الذي يحتوي على PBST. امزج المحتوى في الصف الثاني 10 مرات باستخدام مسدس الماصة.
وبالمثل ، فإن إجراء واحد هو تخفيفان متتاليان للمصل حتى الصف 11. بمجرد الانتهاء من ذلك ، تخلص من 100 ميكرولتر من السائل من الصف 11. أضف 100 ميكرولتر من المصل السلبي والموجب المخفف إلى كل بئر مقابل في الصف 12 باتباع نموذج العينة.
أغلق لوحة ELISA بغلاف بلاستيكي واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. وفي الوقت نفسه ، تمييع الأجسام المضادة الثانوية المضادة للفأر IgG HRP 10،000 مرة عن طريق إضافة PBST. بعد الحضانة لمدة ساعة واحدة ، اغسل لوحة ELISA ب 300 ميكرولتر من PBST لكل بئر لتنظيف الأجسام المضادة غير المنضمة ، ثم أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المخفف إلى كل بئر واحتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.
اغسل الطبق ب 300 ميكرولتر من PBST لكل بئر ، ثم أضف 100 ميكرولتر من محلول تطوير ألوان TMB إلى كل بئر. ضع الألواح على حرارة 37 درجة مئوية وبعيدا عن الضوء لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بإنهاء التفاعل على الفور باستخدام 50 ميكرولترا من حمض الكبريتيك المولي.
اكتشف الكثافة الضوئية أو قيم OD عند 415 نانومتر باستخدام علامة الإنزيم في غضون 15 دقيقة بعد الإنهاء. تم تحليل الخصائص الفيزيائية للقاح المستحلب النانوي الجديد باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ ومجهر القوة الذرية. تم استخدام تشتت الضوء الديناميكي لتحديد توزيع حجم الجسيمات وجهد زيتا للعينة.
أظهر SDS-PAGE والنشاف الغربي أن كمية المستضد في المادة المترسبة والطافية لم تؤجل بشكل كبير بعد الطرد المركزي ، مما يشير إلى أن اللقاح كان سليما من الناحية الهيكلية ومحددا ومناعيا. زاد اللقاح المساعد للمستحلب النانوي بشكل كبير من إجمالي عيار الأجسام المضادة IgG و IgG1 و IgG2a للفئران. تم تحسين مناعة لقاح البروتين بشكل ملحوظ.
كانت قيم مصل IgG2b OD عند 450 نانومتر أعلى عند استخدام PBS عند تخفيف واحد إلى 5،000. يعكس النموذج القاتل لفئران MRSA 252 أن لقاح المستحلب النانوي أظهر تأثيرا وقائيا جيدا ويثبط بشكل فعال العدوى البكتيرية ب MRS A 252 ، مما يحسن معدل بقاء الفئران المصابة. يعد تحضير المستحلب النانوي وإضافة المصل إلى النبات من أهم الأمور.
أيضا ، عند الكشف عن عيار الأجسام المضادة ، ينبغي للمرء أن ينتبه إلى تصحيح أوسع والسائل خارج. إلى جانب المواد المساعدة ، يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة للتطور المناعي لمصفوفات الرياضيات الأخرى ، مثل البلاستيك أو أنظمة التوصيل.
